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在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究张又枝;黄琦;任平【摘要】目的建立一种在特殊材料Transwell培养小室中分离培养原代人脐静脉内皮细胞的技术.方法采用酶消化法分离得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC),免疫荧光法检测内皮因子Ⅷ予以鉴定,待长满后用不含EDTA的0.25％胰酶传代到Transwell小室中,观察小室中HUVEC的生长情况.结果在脐带长度一定的情况下,HUVEC分离所得到细胞的多少以及细胞的状态与胰酶的用量、时间、温度及是否含EDTA关系密切.本研究胰酶消化时间在室温(25℃左右)情况下要消化30min,用的胰酶是含EDTA和不含EDTA的胰酶1∶1混合;长满之后传代消化的胰酶只能用不含EDTA的胰酶消化,时间以在镜下的细胞状态为准.结论在特殊材料Transwell小室中成功分离培养HUVEC,一定要在比较温和的条件下消化HUVEC,这样才可能得到活力比较好、数量比较多的细胞.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2015(029)002【总页数】3页(P96-97,103)【关键词】人脐静脉内皮细胞;Transwell小室;胰酶【作者】张又枝;黄琦;任平【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病及心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100【正文语种】中文【中图分类】R329.3人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在医药学的基础研究中应用广泛，主要是其比较易得到，而且又具有内皮细胞的特征，对疾病的发病机制的研究极为重要。
但是该细胞比较脆弱，极易损伤，在研究中不易得到活力比较好的细胞。
Transwell 小室是一种嵌入细胞培养板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦称为PET 膜，该膜根据孔径不同将其分为不同种的小室，但是共有的特点是其具有通透性，使小室内外培养液的成分相互影响，从而影响细胞的生长、运动等。
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。
HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。
本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。
材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。
2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。
3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。
4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。
5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。
实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。
b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。
c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。
d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。
2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。
b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。
c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。
3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。
b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。
c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。
4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。
b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。
5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。
b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。
结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。
实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。
小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。
此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。
）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。
9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。
2000转/分，离心3分钟。
12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的细胞模型，在很多生物医学研究中被广泛应用。
正确认识和鉴定HUVEC细胞的方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。
然而，由于其细胞特性的多样性和相似性，准确地鉴定HUVEC细胞一直是一个具有挑战性的课题。
目前，主要的HUVEC细胞鉴定方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等。
形态学观察是最直观的方法，通过观察细胞的形态、大小、颜色等特征来初步鉴定。
然而，形态学观察仅仅是最初的鉴定步骤，无法提供确凿的证据。
免疫细胞化学染色是一种常用的鉴定方法，通过使用特异性的抗体标记HUVEC细胞所表达的特定蛋白，如血管内皮细胞相关抗原（CD31）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM-1）等。
这种方法能够在细胞水平上确定细胞的身份，并且具有较高的特异性和敏感性。
另外，遗传学分析也是一种重要的HUVEC细胞鉴定方法。
通过检测HUVEC细胞中特定基因的表达情况或突变情况，如内皮细胞特异性基因（von Willebrand因子、血管内皮生长因子等）的表达，或特定突变基因（如朊病毒受体Eynoltin-2的突变）等，可以进一步确定细胞的身份。
综上所述，准确鉴定HUVEC细胞的方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等多种方法的综合应用。
在进行HUVEC细胞相关研究时，应充分考虑综合运用这些方法来确保实验结果的准确性和可靠性。
未来的研究可以进一步改进和发展更加精确、高效的HUVEC细胞鉴定方法，以满足不断深入的实验需求。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在向读者介绍本篇文章的整体结构，以帮助读者更好地理解和阅读文章。
本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的三个方面。
在概述中，将简要介绍HUVEC细胞的重要性和研究价值。
文章结构部分将向读者展示本文的整体框架，以便读者在阅读过程中能够有条不紊地理解文章内容。
人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会杜利君;蒋兴亮【摘要】目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法.方法:采用0.1％ IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20％胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原.结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列.免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础.【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养【作者】杜利君;蒋兴亮【作者单位】川北医学院附属医院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】R329.2体外建立人血管内皮细胞模型是研究人体大血管内皮功能的主要手段之一。
由于内皮细胞株ECV304在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞比较存在明显差异［1］，因此，体外分离和原代培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)已成为国内外学者获取内皮细胞的重要途径。
本实验在借鉴其他学者体外分离、培养HUVECs技术的基础上，通过大量的实验并对此加以改良，旨在建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的HUVECs的分离、培养方法，为进一步研究血管内皮细胞的功能及阐明相关疾病的生理和病理机制奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料M199培养液和胎牛血清分别为Invitrogen公司和Hyclone公司产品，IV型胶原酶、内皮细胞生长因子(ECGS)、肝素钠均为Sigma公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔IgG抗体为北京中杉金桥公司产品，青霉素和链霉素为华北制药股份有限公司产品。
内皮细胞培养步骤(总结,)1..培养人脐静脉内皮细胞：1 材料与方法1．1 材料1．1．1 新生儿脐带在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。
长度>20 cm，两端扎紧投入到4℃脐带保存液中，1 h内送细胞培养室。
1．1．2 仪器与试剂倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台(苏州净化仪器厂)；5％C02培养箱(美国Heraeus公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；25cm2培养瓶、六孔培养板(美国CA)star公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS)、M199培养基、I型胶原酶(美国Sigrna公司)；明胶、胰酶(美国A1Tlresco公司)；灭菌生理盐水(锦州医学院附属第一医院制剂室)；鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体、辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1．2 方法1．2．1 试剂配制：(1)脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL ／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1链霉素。
(2)磷酸盐缓冲液(PBs)。
(3)D—Hanks液。
(4)0．1％I型胶原酶：用PBS配制。
(5)0．05％胰酶一0．02％乙二胺四乙酸二钠盐(ED—TA)溶液：用D—Hanks液配制。
内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素一100 U／m1链霉素的M199培养基。
(7)0．2％明胶：用PBS配制。
以上试剂均过滤除菌。
1．2．2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养：参照Jaffe 和Lin S等方法并加以改进。
在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。
剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。
用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。
用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止；将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。
细胞说明书（HUVEC）
细胞名称：HUVEC（中文名称：人脐静脉内皮细胞）
细胞简介：HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，来源于人脐静脉，中文名为人脐静脉内皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。
培养方法：
冻存方法：
For research use only
T25瓶细胞处理方法
收到细胞后，检查外包装是否完整，细胞培养瓶是否完好。
如有破损漏液等问题，请即时联系
我们。
1.75%酒精棉球擦拭T25细胞培养瓶外部。
2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（40
×,100×,200×各一张）。
3.将细胞放入37度培养箱中预温1-2小时后再做处理，以稳定细胞状态。
4.预热培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）。
5.若细胞密度较小，无菌操作，去掉培养基。
每瓶添加第四步中准备的5-6ml培养基。
放
到37度培养箱培养。
待细胞密度达到80%以上，进行传代。
6.若细胞密度较大，达到80%以上，将细胞传到10cm培养皿培养。
7.传代时，T25瓶里保留部分细胞，同步培养，直到能确保10cm培养皿中的细胞状态良
好。
人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、冻存、复苏及鉴定1人脐静脉内皮细胞的分离及培养1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。
前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。
其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。
1.1.1胰蛋白酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。
一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。
待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。
37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。
取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。
取0.1mL 细胞悬液在血细胞计数板计数。
最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。
置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。
以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。
1.1.2胶原酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。
超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。
消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。
原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结刘文;陈瑞云;王志伟【摘要】目的建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法.方法采用0.125％胰酶+0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定.结果原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论 0.125％胰酶+0.01％EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2016(024)008【总页数】3页(P11-13)【关键词】原代人脐静脉内皮细胞;分离;细胞培养【作者】刘文;陈瑞云;王志伟【作者单位】山东省青岛科技大学校医院内科,山东青岛266044;山东省青岛大学第二附属医院胃肠外科,山东青岛266042;山东省青岛大学第二附属医院肛肠外科,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q813.11血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是血管内表面的单层扁平上皮，构成了血管壁与血液之间的机械屏障，EC能吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，能分泌很多生物活性物质以调节血管通透性、参与凝血和动脉粥样硬化过程，还能通过调节血管的收缩和舒张以调节血压等。
为研究人体大血管内皮功能需要体外建立人血管内皮细胞模型，而内皮细胞株ECV304,在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞存在明显差异[1]，因此，体外分离培养原代人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是获取内皮细胞的重要途径。
本实验总结了体外培养HUVECs的方法，应用消化酶灌注法,成功分离了人脐静脉内皮细胞，获取了大量的HUVECs，创建了研究内皮细胞的模型。
1 材料与方法1.1 标本来源脐带均来自于剖宫产的新生儿脐带，于无菌条件下获取，迅速转移至细胞室超净台中，进行分离培养。
人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波【摘要】目的:建立能大量分离人脐静脉内皮细胞的体外培养的简便方法,分析人脐静脉内皮细胞抗原表达的特点.方法:采用玻璃接管连接医用三通管灌注0.133%胶原酶I法分离脐静脉内皮细胞,培养于10%胎牛血清的人内皮细胞培养液(含β-促内皮细胞生长因子和肝素钠),培养皿用1.5%明胶包被,促进内皮细胞贴壁.培养过程中观察细胞的形态特征,同时行免疫组织化学染色检测第八因子相关抗原、CD31表达情况,鉴定内皮细胞来源.结果:成功获取人脐静脉内皮细胞,原代人脐内皮细胞24 h贴壁,第5日细胞融合;第八因子相关抗原和CD31呈广泛的阳性表达.第八因子相关抗原阳性染色程度高于CD31,证实为人脐静脉内皮细胞.结论:应用玻璃接管连接医用三通管灌注胶原酶消化法分离脐静脉内皮细胞,利用10%优质胎牛血清的人内皮细胞培养基,添加β-促内皮细胞生长因子和肝素钠,并用1.5%明胶包被培养皿,能简单有效培养人脐静脉内皮细胞.【期刊名称】《眼科学报（英文版）》【年(卷),期】2010(025)002【总页数】4页(P99-102)【关键词】人脐静脉内皮细胞;细胞培养方法;鉴定【作者】林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波【作者单位】中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060;中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060;中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060;中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060;中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060;中山大学眼科学国家重点实验室中山大学中山眼科中心,广州,510060【正文语种】中文体外人血管内皮细胞已成为眼部新生血管等血管性疾病研究，尤其是糖尿病血管并发症机制研究的重要途径之一。
人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定权燕;郑练【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2009(22)4【摘要】目的:寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养方法。
方法:在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。
结果:改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈"铺路石"状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。
结论:本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。
【总页数】4页(P209-211)【关键词】人脐静脉;内皮细胞;细胞培养;分离;鉴定【作者】权燕;郑练【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院小儿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术 [J], 吴金义;张蕾;张秀英;曲丽梅2.人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达 [J], 吴世卿;郑俊发;曾曙光;陈少鹏;薛国初;章锦才3.人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定 [J], 林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波4.人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 牛成伟;曹凯5.人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定 [J], 阮溦;李锁北;戴如平;徐军美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管内皮细胞原代培养（人脐带静脉灌流消化法）
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（tumor angiogenesis factor,TAF）等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可
于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线
绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0. 1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防
液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲
洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。
5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。
两至三天可见细胞长成单层。
•。
实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。
实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 每2-3天更换一次培养基。
3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。
二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。
三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。
3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。
四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。
五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。
实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。
二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。
三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
材料与方法一、材料与培养用液的配制CK 型倒置显微镜(日本Olympus Tokyo 公司),流式细胞仪(Coulter 公司),BB 5060型CO 2培养箱(美国Heraeus),Cryfuge500S 型低温离心机,胎牛血清(FBS,100ml/瓶,H yclone 公司),人血管内皮生长因子(VEGF,10 g/支,Pepro Tech 公司),CD31PE 购自Becton Dickison 公司(编号:340297)。
培养用液:(1)PBS 液:Nacl 8.5g 、Kcl 0.2g 、NaH 2PO 4H 2O 2g 、KH 2PO 40.2g 溶于1000三蒸水中,120!灭菌20m in,分装备用。
(2)胶原酶(Gibco公司,10mg/支)和胰蛋白酶(上海华美公司)分别溶于100ml PBS 中,浓度分别为0.1%和0.25%,抽滤消毒备用。
(3)DMEM 培养基(购自BRL-Gibco 生命技术公司):按照说明书操作,将一袋干粉溶于1000ml 三蒸水中,抽滤消毒,加入胎牛血清终浓度为10%,4!贮存备用。
二、方法1.内皮细胞原代培养:无菌获取新生儿脐带,立即用生理盐水冲洗血迹,剪去钳痕和血肿部位,再用PBS 液冲净脐静脉内血迹。
将脐带一端用丝线结扎固定,用注射器向脐静脉另一端内注满0.1%胶原酶液,止血钳钳夹后放入水浴锅内孵育15min 。
取出脐带松开血管钳释放酶细胞混合液于离心管中,再用PBS 液冲洗脐静脉后一并收集于离心管中,1000rpm ∀8min 。
弃去上清液,转移至35cm 2培养瓶(Falcon 公司)中,加入DM EM 培养液(内含10%胎牛血清,青霉素100U/ml、链霉素100 g/ml,VEGF20ng/ml), 5%CO2、37!条件下培养,24h后换液1次,以后每2 ~3d换液1次。
2.传代培养:原代培养内皮细胞80%以上汇合时,倾去培养液后用DM EM培养液冲洗,然后加入0. 25%胰蛋白酶消化,在倒置显微镜下观察见细胞皱缩、彼此分离或出现大片状分离即加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中止消化,并用吸管反复吹打瓶壁制成细胞悬液,计数后按105个/ml分装成瓶继续培养。
3.血管内皮细胞的鉴定(1)倒置显微镜下观察细胞形态并摄片,待培养细胞将近汇合时,更换新鲜培养液摄片。
(2)流式细胞术:待细胞长满单层后,以胰蛋白酶消化并反复吹打制成单细胞悬液,离心后去上清液,再用PBS液洗涤2次以排除培养液可能的干扰。
加入CD31PE20 l,充分摇匀,闭光孵育30min。
结合多抗的细胞加入FIT C标记的羊抗鼠多克隆稀释抗体,闭光15min后立即行流式细胞术分析,结果以荧光图表示。
设阴性对照组,不加一抗,其余操作相同。
FM 术检测vWF因子与CD31相似,一抗为抗人vWF抗体。
结 果一、倒置显微镜观察 原代细胞接种12h后开始贴壁,24h后大部分贴壁生长。
早期细胞球形、椭圆形及团块状,仅少数细胞伸展,48~72h后生长最快、变成梭形。
5~7d后融合,呈现典型的镶嵌状卵石样排列。
传代细胞的形态变化及生长方式与原代培养细胞类似,汇合后细胞也呈卵石样排列(见图1)。
图1 培养细胞倒置显微镜观察 二、流式细胞术鉴定内皮细胞 与对照相比,细胞表面的CD31表达荧光强度相似,表明培养细胞也有CD31表型存在。
vWF因子的荧光强度与对照相比无明显的差异,进一步说明培养细胞为血管内皮细胞(见图2)。
anti PECA M(CD31) anti vWF图2 培养细胞CD31和vWF因子荧光密度表达讨 论新生儿脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源,具有取材方便、操作简单易掌握、获得细胞多等优点,能够很好的满足基础和临床研究的需要。
国外Jaffe等人于1973年培养人脐静脉内皮细胞获得成功,我们则主要参考张宝庚等人的方法也培养成功,并通过细胞形态学、细胞生长特性、细胞表型和特异性分泌抗原证实。
血管内皮细胞的贴壁生长受诸多因素的影响,首先,是脐带离体时间的影响。
王建明等[1]人的研究表明,随时间延长离体脐带内皮细胞某些物质的含量会发生变化,6h至12h内皮细胞V因子相关抗原、前列环素呈下降趋势,程满根等[2]人研究表明脐带离体3h内内皮细胞存活率达90%,离体24h仅有50%存活。
一般实验时取足月分娩新生儿脐带,经简单的去除血迹等处理即进行消化培养。
其次,在内皮细胞获取方法上有:(1)离心分离法,主要用于血细胞等的分离。
(2)机械分散法,如Priebe等[3]使用带有尼龙筛的分离管刮取内皮获得细胞,体外培养成功。
(3)消化分离法,如胰蛋白酶、胶原酶及EDTA进行消化,一般很少混杂平滑肌细胞和成纤维细胞,我们应用胶原酶 获取足够内皮细胞,并且未见细胞污染。
第三,培养基质的影响,进口培养瓶因加入促细胞贴壁物质利于细胞生长而广泛应用,我们选用Falcon公司35cm2培养瓶效果满意。
同时预先于瓶底面铺加0.1%明胶蛋白(gelatin),它是一种变性胶原,具有良好的亲合性,能与许多细胞自然配位结合使细胞更容易贴壁生长,且具有很好的光学性质便于观察。
第四,培养液的影响,常用培养基DM EM、RPM I1640及M199均可用于内皮细胞的培养,但是必需加入血清,细胞才能更好地生长。
因为,血清含有供细胞生存所必需的生长调节因子,为培养液提供良好的缓冲系统,利于细胞贴壁和铺展等特殊作用,是一种优良的天然培养基。
实验中,我们加入10%胎牛血清(fetal bovine serum),从而使细胞在体外良好生长。
第五,传代对H UVEC产生很大影响,有人检测出随着培养代数的增加,细胞形态和功能发生明显的变化,传代2个月后不仅出现较多的#巨细胞∃,细胞群稀疏,透光度下降,最后死亡,而且在功能上分泌前列环素和vWF因子的功能逐渐下降、直至消失[4]。
另外,HU VEC的传代较困难,一般仅能传2~3代,为此我们于培养液中加入血管内皮生长因子(VEGF),后者对血管内皮具有特异的促有丝分裂作用,有利于多次传代培养。
第六,细菌、霉菌和支原体污染培养物也较常见,使培养细胞生理、生化、遗传学等方面发生变化,只能废弃。
对于细菌、霉菌和支原体污染,培养基中预防性的加入青霉素、链霉素和二性霉素,而支原体污染迄今尚无行之有效的方法。
