人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定

人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定权燕;郑练【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2009(22)4【摘要】目的:寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养方法。

方法:在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。

结果:改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈"铺路石"状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。

结论:本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。

【总页数】4页(P209-211)【关键词】人脐静脉;内皮细胞;细胞培养;分离;鉴定【作者】权燕;郑练【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院小儿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术 [J], 吴金义;张蕾;张秀英;曲丽梅2.人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达 [J], 吴世卿;郑俊发;曾曙光;陈少鹏;薛国初;章锦才3.人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定 [J], 林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波4.人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 牛成伟;曹凯5.人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定 [J], 阮溦;李锁北;戴如平;徐军美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。

方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。

结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。

内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。

结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。

[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。

方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。

结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。

结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。

%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。

ScienCell原代细胞培养方法2018.06.01原代细胞在复苏和传代前一定要包被培养瓶，以促进细胞贴壁。

以人脐静脉内皮细胞（sciencell，货号#8000）为例：1.培养瓶包被包被液纤维粘连蛋白（sciencell，货号#8248）以1-2ug/cm2的浓度包被培养瓶。

可将1mg/ml的纤维粘连蛋白不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（sciencell，货号#0303）稀释100倍，T-75培养瓶中加入10ml左右，37度孵箱1小时或4度冰箱过夜，并用灭菌双蒸水洗涤培养瓶2遍（此步骤非常重要，必须清洗2遍），包被好的培养瓶不要放置超过24小时。

2.配制培养基以ECM培养基为例把胎牛血清（sciencell，货号#0025）、生长因子（sciencell，货号#1052）和双抗（sciencell，货号#0503）加入培养液中，混匀后的完全培养基于4度保存，应尽快使用。

可分装以延长效期。

3.细胞复苏在培养瓶中加入配制好的ECM培养基10ml（推荐复苏至T75培养瓶，如T25瓶子加5ml）从液氮中取出冻存原代细胞，37度水浴冻融，冻融过程中可以轻轻转动细胞，加快冻融速度（注意原代细胞复苏时一定不要离心），将融化的细胞放入已加入培养基的培养瓶中，再用1ml培养基洗涤细胞冻存管，保证原代细胞都被加入培养瓶中，然后静置于孵箱，12-16小时后更换培养基以除去DMSO。

4.原代细胞传代细胞生长至70-80%左右可以传代，传代比例1:2或1:3为佳。

首先弃去培养基，PBS或D-Hank’s液洗涤培养瓶2遍，加入适量0.25%Trypsin-EDTA，37度孵育，轻拍培养瓶侧面，显微镜下观察原代细胞消化情况。

细胞消化好后，加入适量的胰酶中和液以中和胰酶，然后将原代细胞和培养基转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。

然后弃去上清液，以1-2ml培养基重新悬浮原代细胞，加入包被好的已加入培养基的培养瓶中。

根据原代细胞生长情况，大概每2天更换培养基。

内皮细胞培养步骤(总结,)1..培养人脐静脉内皮细胞：1 材料与方法1．1 材料1．1．1 新生儿脐带在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。

长度>20 cm，两端扎紧投入到4℃脐带保存液中，1 h内送细胞培养室。

1．1．2 仪器与试剂倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台(苏州净化仪器厂)；5％C02培养箱(美国Heraeus公司)；离心机(上海安亭仪器厂)；25cm2培养瓶、六孔培养板(美国CA)star公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS)、M199培养基、I型胶原酶(美国Sigrna公司)；明胶、胰酶(美国A1Tlresco公司)；灭菌生理盐水(锦州医学院附属第一医院制剂室)；鼠抗人Ⅷ因子单克隆抗体、辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1．2 方法1．2．1 试剂配制：(1)脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL ／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1链霉素。

(2)磷酸盐缓冲液(PBs)。

(3)D—Hanks液。

(4)0．1％I型胶原酶：用PBS配制。

(5)0．05％胰酶一0．02％乙二胺四乙酸二钠盐(ED—TA)溶液：用D—Hanks液配制。

内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、ECGS、肝素，100 U／m1青霉素一100 U／m1链霉素的M199培养基。

(7)0．2％明胶：用PBS配制。

以上试剂均过滤除菌。

1．2．2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养：参照Jaffe 和Lin S等方法并加以改进。

在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。

剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。

用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。

用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止；将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。

原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结刘文;陈瑞云;王志伟【摘要】目的建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法.方法采用0.125％胰酶+0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定.结果原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论 0.125％胰酶+0.01％EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2016(024)008【总页数】3页(P11-13)【关键词】原代人脐静脉内皮细胞;分离;细胞培养【作者】刘文;陈瑞云;王志伟【作者单位】山东省青岛科技大学校医院内科,山东青岛266044;山东省青岛大学第二附属医院胃肠外科,山东青岛266042;山东省青岛大学第二附属医院肛肠外科,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q813.11血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是血管内表面的单层扁平上皮，构成了血管壁与血液之间的机械屏障，EC能吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，能分泌很多生物活性物质以调节血管通透性、参与凝血和动脉粥样硬化过程，还能通过调节血管的收缩和舒张以调节血压等。

为研究人体大血管内皮功能需要体外建立人血管内皮细胞模型，而内皮细胞株ECV304,在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞存在明显差异[1]，因此，体外分离培养原代人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是获取内皮细胞的重要途径。

本实验总结了体外培养HUVECs的方法，应用消化酶灌注法,成功分离了人脐静脉内皮细胞，获取了大量的HUVECs，创建了研究内皮细胞的模型。

1 材料与方法1.1 标本来源脐带均来自于剖宫产的新生儿脐带，于无菌条件下获取，迅速转移至细胞室超净台中，进行分离培养。

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。

）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。

2000转/分，离心3分钟。

12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。

huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的细胞模型，在很多生物医学研究中被广泛应用。

正确认识和鉴定HUVEC细胞的方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。

然而，由于其细胞特性的多样性和相似性，准确地鉴定HUVEC细胞一直是一个具有挑战性的课题。

目前，主要的HUVEC细胞鉴定方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等。

形态学观察是最直观的方法，通过观察细胞的形态、大小、颜色等特征来初步鉴定。

然而，形态学观察仅仅是最初的鉴定步骤，无法提供确凿的证据。

免疫细胞化学染色是一种常用的鉴定方法，通过使用特异性的抗体标记HUVEC细胞所表达的特定蛋白，如血管内皮细胞相关抗原（CD31）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM-1）等。

这种方法能够在细胞水平上确定细胞的身份，并且具有较高的特异性和敏感性。

另外，遗传学分析也是一种重要的HUVEC细胞鉴定方法。

通过检测HUVEC细胞中特定基因的表达情况或突变情况，如内皮细胞特异性基因（von Willebrand因子、血管内皮生长因子等）的表达，或特定突变基因（如朊病毒受体Eynoltin-2的突变）等，可以进一步确定细胞的身份。

综上所述，准确鉴定HUVEC细胞的方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等多种方法的综合应用。

在进行HUVEC细胞相关研究时，应充分考虑综合运用这些方法来确保实验结果的准确性和可靠性。

未来的研究可以进一步改进和发展更加精确、高效的HUVEC细胞鉴定方法，以满足不断深入的实验需求。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在向读者介绍本篇文章的整体结构，以帮助读者更好地理解和阅读文章。

本文分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分包括概述、文章结构和目的三个方面。

在概述中，将简要介绍HUVEC细胞的重要性和研究价值。

文章结构部分将向读者展示本文的整体框架，以便读者在阅读过程中能够有条不紊地理解文章内容。

人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会杜利君;蒋兴亮【摘要】目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法.方法:采用0.1％ IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20％胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原.结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列.免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础.【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养【作者】杜利君;蒋兴亮【作者单位】川北医学院附属医院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】R329.2体外建立人血管内皮细胞模型是研究人体大血管内皮功能的主要手段之一。

由于内皮细胞株ECV304在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞比较存在明显差异［1］，因此，体外分离和原代培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)已成为国内外学者获取内皮细胞的重要途径。

本实验在借鉴其他学者体外分离、培养HUVECs技术的基础上，通过大量的实验并对此加以改良，旨在建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的HUVECs的分离、培养方法，为进一步研究血管内皮细胞的功能及阐明相关疾病的生理和病理机制奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料M199培养液和胎牛血清分别为Invitrogen公司和Hyclone公司产品，IV型胶原酶、内皮细胞生长因子(ECGS)、肝素钠均为Sigma公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔IgG抗体为北京中杉金桥公司产品，青霉素和链霉素为华北制药股份有限公司产品。

人脐静脉内皮细胞培养1 材料1.1 取材新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的PBS，并加上200 U/ml 青链霉素)，产后4 h 内最佳，一定不要超过24 h，实验前保存在4℃冰箱中。

1.2 试剂0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199 均可)；培养液(M199、50 μg/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmol⋅L-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。

平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks’液)；1%明胶。

1.3 器械烧杯(脐带数＋2)、止血钳(脐带数×2＋2)、镊子2 把、手术直剪(脐带数×1)、12 号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数×1)、玻璃培养皿。

2 方法2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2 ml培养液(含10%血清的普通培养液)冲洗培养瓶一遍，放置超净台中。

2.2 去妇产科取当天新鲜脐带。

2.3 将取出的脐带放在盛有含双抗PBS 的玻璃培养皿中，洗净脐带表面的残留血液，将脐带两端各剪去一部分；更换一个新的玻璃培养皿，辨别脐带静脉(粗大的那根)，顺着静脉插入大针头，注入含双抗PBS，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液；再更换一个培养皿，加少许PBS，把脐带放在培养皿中，从针头打入胶原酶(37℃预温)，当胶原酶从另一头流出少许的时候，用止血钳夹闭，继续注入胶原酶使脐带充盈后也封闭，37℃消化15 min(室温30℃ 20 min)。

消化结束后收集所有消化液，吸取PBS 冲洗脐带，合并到消化液中，1000 rpm 离心5 min，弃上清，加入4 ml 培养液悬浮细胞，接种到明胶包被的塑料培养瓶中，12-24 h 后换液一次。

一般一根脐带消化下来的细胞可以培养一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔，细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。

2.4 3-4 天长满后用胰酶(含EDTA)消化以1:2 传代时。

人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、冻存、复苏及鉴定1人脐静脉内皮细胞的分离及培养1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。

前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。

其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。

1.1.1胰蛋白酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。

一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。

待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。

37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。

取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。

取0.1mL 细胞悬液在血细胞计数板计数。

最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。

置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。

以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。

1.1.2胶原酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。

超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。

消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。

细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。

3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。

细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。

2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。

1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。

3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。

细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。

细胞说明书（HUVEC）
细胞名称：HUVEC（中文名称：人脐静脉内皮细胞）
细胞简介：HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，来源于人脐静脉，中文名为人脐静脉内皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。

培养方法：
冻存方法：
For research use only
T25瓶细胞处理方法
收到细胞后，检查外包装是否完整，细胞培养瓶是否完好。

如有破损漏液等问题，请即时联系
我们。

1.75%酒精棉球擦拭T25细胞培养瓶外部。

2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（40
×,100×,200×各一张）。

3.将细胞放入37度培养箱中预温1-2小时后再做处理，以稳定细胞状态。

4.预热培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）。

5.若细胞密度较小，无菌操作，去掉培养基。

每瓶添加第四步中准备的5-6ml培养基。

放
到37度培养箱培养。

待细胞密度达到80%以上，进行传代。

6.若细胞密度较大，达到80%以上，将细胞传到10cm培养皿培养。

7.传代时，T25瓶里保留部分细胞，同步培养，直到能确保10cm培养皿中的细胞状态良
好。