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一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法作者：李琴山冯赞杰刘洋徐海燕钱民章【关键词】 ,内皮细胞；脐静脉；细胞培养【Abstract】 AIM: To establish a stable method to isolate and culture human umbilical vein endothelial cells (hUVEC) in vitro. METHODS: Endothelial cells of vein from newborn umbilical cord were successfully isolated using a combination of collagenase and trypsin (1∶1). Cells were not digested with trypsin until the cells reached confluence over 80%. The composition of culture medium was simplified by not adding vascular endothelial cell growth factor and heparin. The cultured cells were verified as hUVEC by morphology and immunofluorescence staining. RESULTS: The endothelial cells initially spread on the bottom of the dishes in 4 h, then coalesced and grew to form confluent monolayers of polygonal cells within 7-10 d. The cultured cells had a cobblestone appearance with a strict monolayer growth and contact inhibition. The purity of endothelial cells was more than 95% identified by immunocytochemistry staining for Ⅷ:Ag and KDR. CONCLUSION: Method of injection with mixed Enzyme solution is an optimized protocol which is reliable and of high achievement ratio. Cellsharvested with this protocol can be used as models on research of vascular endothelial cells in vitro.【Keywords】 endothelial cell; umbilical vein; cell culture【摘要】目的：建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法：采用胰蛋白酶/胶原酶（1∶1）混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞，简化完全培养液组分（不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子），当原代培养细胞80％以上汇合后用胰蛋白酶消化传代；用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果：种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长，48~96 h生长最快，7~10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观，Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ：Ag）和内皮细胞生长因子受体2（KDR）鉴定内皮细胞纯度达95％以上. 结论：用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，可靠性大，成功率高，可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.【关键词】内皮细胞；脐静脉；细胞培养0引言血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位［1］. 采用培养的VEC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法. 由于人体组织取材限制，很难获取大量原代培养的人VEC.我们以健康胎儿脐静脉血管为材料，建立起一种改良的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, hUVEC）培养方法.1材料和方法1.1材料新生儿脐带由遵义医学院附属医院提供；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、EDTA（Sigma公司）；M199、胎牛血清（Gibco公司）；台盼蓝(Amresco公司进口分装)；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2（KDR）抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）、倒置相差显微镜（日本Nikon公司）, CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）、酶标仪（德国Huma Reader公司）. 完全培养液为800 mL/L M199培养液、200 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素，使用前调节pH至7.0~7.4.1.2方法1.2.1hUVEC的分离和培养在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h内［2］的脐带，长约30 cm,剪去脐带两端钳夹处. 于脐静脉一端插入一针头，用生理盐水反复冲洗至无血迹后，将脐静脉另一端用止血钳夹紧，用空针封闭. 灌入1 g/L胶原酶和2.5 g/L胰蛋白酶（1∶1）（V/V） 15 mL，置37℃水浴箱中孵育8 min，将消化液收集入离心管，用PBS冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000 r/min 离心10 min，去上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1 mL细胞悬液用4 g/L台盼蓝染色后作活细胞计数. 将1.5×107/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1 mL，置37℃，950 mL/L O2，50 mL/L CO2培养箱内静置培养，次日换培养液，以后每3 d换液1次，7~10 d 融合.1.2.2细胞计数采用台盼蓝排斥法. 取0.1 mL混匀的内皮细胞悬液与4 g/L台盼蓝0.9 mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞. 当细胞悬液中细胞存活率大于95%时可用于进行原代细胞培养.1.2.3hUVEC的鉴定［3-5］用Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand 因子抗体）以及KDR抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 将酸化处理的普通盖玻片消毒后放入6孔培养板，将原代或传代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，当细胞生长至近融合状态时用PBS缓冲液冲洗细胞爬片，-20℃丙酮固定10 min；PBS缓冲液洗3次，5 min/次；用30 mL/L H2O2,室温孵育5 min，灭活内源性过氧化物酶；分别滴加适量鼠抗人Ⅷ因子一抗工作液（1∶100）； KDR（1∶200）一抗工作液，37℃作用60 min；PBS缓冲液洗3次，每次5 min；再分别滴加羊抗鼠的IgGFITC 和IgGTR的二抗工作液，37℃作用30 min后，PBS洗涤3次. 立即在荧光显微镜下观察、摄片. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR；GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子. 对于Ⅷ因子相关抗原还采用免疫细胞化学SABC法进行检测，显微镜下观察.1.2.4hUVEC的消化传代①取生长融合的细胞吸去培养液，PBS洗2次；②翻转培养瓶，加入1.25 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA 的细胞消化液；③倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞与细胞分开、胞体变圆变亮时翻转培养瓶，吸去消化液；④加入完全培养液，小心吹散细胞，计数，接种到新的培养瓶或培养板, 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.1.2.5细胞生长曲线的测定取待测生长状态良好细胞，增长至接近汇合时向培养瓶内加入1 mL 1.25 g/L胰蛋白酶液消化，待细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加入完全培养液，轻轻吹打制成细胞悬液、计数. 向24孔板的每孔中接种等量细胞，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 将细胞分成8组，每组3孔，培养8 d. 从接种次日起每24 h分别取3个孔计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线.2结果2.1hUVEC的培养与鉴定在倒置显微镜下连续观察，培养的原代内皮细胞在接种4 h之后开始贴壁生长，细胞呈球形、小多角形，单个或小团块存在. 接种第2～3日，细胞即进入对数生长期，细胞生长迅速；第5～8日时铺满培养瓶瓶底，呈现典型的铺路石样形态特征(图1). Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%以上为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色，胞核为蓝色(图2). KDR(图3)和Ⅷ因子(图4)免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.图1培养6 d的原代脐静脉内皮细胞（略）图2脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫组化检测（略）图3脐静脉内皮细胞内皮细胞生长因子受体2免疫荧光检测（略）2.2hUVEC生长曲线测定通过细胞计数,接种后第1日，细胞较接种时无明显变化，此时细胞仍处于滞留期，第2日则明显增加，第3~5日增长迅速,达到其生长高峰，此时细胞处于对数生长期，第6~8日细胞生长稳定,处于生长平台期(图5).图4脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫荧光检测（略）图5原代人脐静脉内皮细胞生长曲线（略）3讨论我们以人脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源，是因为它具有取材及操作方便，获得细胞数多，在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点.获取内皮细胞的方法有机械刮取［6］、组织块移植和酶消化法3种. 前两种易混杂其它血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代. 从分离细胞数量、保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，自成功分离hUVEC以来，已得到广泛应用，但其价格昂贵. 用胰蛋白酶代替胶原酶分离血管内皮细胞已有文献报道. 我们比较了全胶原酶和胰蛋白酶加胶原酶混合两种酶液的消化能力，结果表明，采用胰蛋白酶加胶原酶混合消化的方法，hUVEC 收获量基本接近全胶原酶血管内皮细胞的收获量. 在混合酶液中，胶原酶仅占1/2，这种方法既经济，效果又好. 而且用胰蛋白酶处理可以降低非内皮细胞的贴壁能力，内皮细胞的贴壁能力比平滑肌细胞和成纤维细胞早，所以在接种后6 h可以去除未贴牢的细胞，这些非内皮细胞的污染如不去除，将抑制内皮细胞的增殖.hUVEC较动物内皮细胞的培养困难，只有在培养液中加入刺激细胞生长的物质，方能长期传代培养. 董玉兰等［7］和Relou等［8］报道，培养液中加入人血清、血管内皮细胞生长因子、肝素及培养瓶（皿）用明胶覆盖是hUVEC长期培养的重要条件. 但这些促进内皮细胞贴壁及生长的物质的加入可能成为影响实验结果的混杂因素，限制内皮细胞的实验应用范围. 有人［9-11］研究发现，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等有助于培养的胚胎干细胞分化为内皮细胞. 胚胎干细胞有望成为新的种子细胞来源. 我们在改进内皮细胞分离和传代方式的基础上选择M199培养基，补充200 mL/L胎牛血清和2 mmol/L L谷氨酰胺，在维持内皮细胞正常生长和形态结构的前提下尽可能减少完全培养液的组分，能将hUVEC传5～6代. 总之，我们改进的hUVEC培养方法可获取足够数量高纯度可传代的内皮细胞，对内皮细胞生物学特性和心脑血管相关疾病的研究有重要意义.【参考文献】［1］ Li XD, Lu kH, Guo SZ, et al. Culture of vascular endothelial cell ［J］. Chin J Aesthetic Med, 2001,10(3):18-20.［2］王建民，刘荫秋，赖西南. 正常脐静脉离体后不同时间内皮某些物质含量的变化［J］. 第三军医大学学报，1995，17（1）：86.［3］ Jonathan B. Rosenberg, Judith S, et al. Genetic induction of a releasable pool of factor Ⅷ in human endothelial cells ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20 (12)：2689-2695.［4］李孟彬，王为忠，张宏伟，等. 猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定［J］. 第四军医大学学报，2004，25（24）：45.［5］ Mario P, Afazal J, Daniel P, et al. Expression of VEGFR2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］. Blood, 2000,95（3）：952-958.［6］ Quattrone S, Chiappini L, Scapagnini G, et al. Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture ［J］. Mol Hum Reprod, 2004,10(5): 325-330.［7］董玉兰，陈铁镇，王铁吉,等. 人脐静脉内皮细胞的继代培养［J］. 中国医科大学学报，1989，18（2）：81-85.［8］ Relou IAM, Damen CA, Van der Schaft. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness ［J］. Tissue Cell, 1998,30(5):525-530.［9］ Evans GR, Brandt K, Klatz S, et al. Bioactive poly(Llactic acid) conduits seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration［J］. Biomaterials, 2002,23(1):841.［10］ Liang PF, Zhang PH, Yang XH, et al. Experimental study on inductionof endothelial apoptosis by burn serum and subeschar tissue fluid ［J］.中华烧伤杂志,2004,20(5):275-277.［11］ Savore C, Zhang C, Muir C, et al. Perlecanknockdown in metastatic prostate cancer cells reduces heparinbinding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo ［J］. Clin Exp Metastasis,2005,22(5):377-390.。
人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【摘要】目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2010(038)007【总页数】3页(P605-607)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养技术;细胞分离;连续传代【作者】张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【作者单位】300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室【正文语种】中文人的内皮细胞是血管壁的主要组成部分，在维持组织稳态、纤溶与凝血、血液组织交换、血管舒缩调节、血管新生、血细胞激活和迁移等生理和病理过程中发挥着重要作用，另外在免疫反应起始过程中也起着决定性的作用[1]。
因此体外获得血管内皮细胞可为阐明许多疾病血管并发症的病理过程提供重要研究模型[2]。
新生儿脐带由于取材经济、来源充足,而成为血管内皮细胞体外获得的主要材料。
第 50 卷第 2 期2024年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.2Mar.2024DOI：10.13481/j.1671‐587X.20240209丹参酮ⅡA磺酸钠对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞功能的影响王立华1, 贾岚1, 陈海燕1, 杨波2, 王喆1, 毕学青1（1. 天津医科大学第二医院肾脏病血液净化科，天津300211；2. 天津中医药大学第一附属医院肾内科，天津301617）［摘要］目的：探讨丹参酮ⅡA磺酸钠（STS）对尿毒症毒素作用下人脐静脉内皮细胞（hUVECs）功能的影响，并阐明其作用机制。
方法：将hUVECs进行传代培养并分为空白对照组、尿毒症毒素刺激组、尿毒症毒素+STS组和尿毒症毒素+STS+细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂组，其中后2组中STS的浓度为10 mg·L-1；先给予各组剪切力刺激，剪切力大小为12 dyn·cm-2；采用CCK-8法测定各组细胞增殖活性，Western blotting法检测各组细胞中ERK、核因子κB（NF-κB）和Ⅰ型胶原蛋白表达水平，实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法检测细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原mRNA表达情况；原位末端转移酶标记技术（TUNEL）法检测各组细胞凋亡率。
结果结果：：CCK-8法检测，在剪切力作用后，尿毒症毒素刺激组和尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞增殖活性低于尿毒症毒素+STS组（P<0.01）。
Western blotting法检测，与尿毒症毒素组比较，尿毒症毒素+STS组细胞中ERK、NF-κB和Ⅰ型胶原蛋白表达水平升高（P<0.01）；抑制ERK信号通路后，与空白对照组、尿毒症毒素组和尿毒症毒素+STS组比较，尿毒症毒素+STS+ERK抑制剂组细胞中ERK、NF-κB 和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。
HUVEC 人脐静脉血管内皮细胞General Information:
Culture Method:
具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。
由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，
时和我们联系武汉普诺赛生命科技有限公司
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注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象
发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需
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3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。
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此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及
4. 静置细胞贴壁后，请将细胞瓶内的培养基倒出，留6~8mL 维持细胞正常培养，待细胞
汇合度90%左右时正常传代。
5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传
代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。
6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部
沟通交流
告知细胞的。
《清肾颗粒对慢性肾衰竭患者血黏附分子、趋化因子及LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的干预作用》一、引言慢性肾衰竭（CRF）是一种临床常见的肾脏疾病，其主要特点为肾功能逐渐减退，临床表现为肾功能衰竭及代谢性酸中毒等。
对于此类患者，血管内皮细胞的损伤与疾病的发展密切相关。
因此，针对血管内皮细胞的保护和修复是治疗慢性肾衰竭的重要途径之一。
近年来，清肾颗粒作为一种中成药在慢性肾衰竭的治疗中得到了广泛应用。
本文旨在探讨清肾颗粒对慢性肾衰竭患者血黏附分子、趋化因子及LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的干预作用。
二、研究方法1. 研究对象本研究选取了慢性肾衰竭患者作为研究对象，按照随机、双盲、对照的原则，将患者分为治疗组和对照组。
2. 药物干预治疗组患者口服清肾颗粒，对照组患者口服安慰剂。
两组患者的其他治疗措施保持一致。
3. 检测指标检测两组患者治疗前后血中黏附分子、趋化因子水平的变化，以及LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤情况。
三、结果1. 血黏附分子、趋化因子水平变化经过一段时间的治疗，治疗组患者的血黏附分子、趋化因子水平较治疗前有明显降低，而对照组患者的变化不明显。
这表明清肾颗粒能够有效地降低慢性肾衰竭患者血中的黏附分子、趋化因子水平。
2. LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤情况清肾颗粒对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。
治疗后，治疗组患者的内皮细胞损伤程度较治疗前明显减轻，而对照组患者的内皮细胞损伤程度无明显变化。
这表明清肾颗粒能够有效地减轻LPS对内皮细胞的损伤。
四、讨论本研究结果表明，清肾颗粒对慢性肾衰竭患者的血黏附分子、趋化因子水平及LPS诱导的人脐静脉内皮细胞损伤具有明显的干预作用。
这可能与清肾颗粒的成分有关，其含有多种中草药成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，能够有效地减轻炎症反应，保护血管内皮细胞。
此外，清肾颗粒还能够改善肾功能，降低尿素氮、肌酐等代谢产物的水平，从而减轻肾脏负担，进一步保护血管内皮细胞。
第39卷第4期20 2 1年4月中华中医药学刊C H I N E S E A R C H I V E S O F T R AD I T I O N A L C H I NE S E M E D I C I N EV〇1.39 No. 4Apr. 2 0 2 1D()I：10. 13193/j. issn. 1673-7717.2021.04.053牡丹皮功效部位含药血清对H202诱导损伤的人脐静脉内皮细胞的增效作用吴冰帆1，张留记1’2，李开言2，王建霞1，屠万倩2(1.河南中医药大学，河南郑州450008; 2.河南省中医药研究院，河南郑州45_)摘要：目的探讨牡丹皮功效部位含药血清对过氧化氢（H202 )诱导损伤的人脐静脉内皮细胞（H U V E C)的保护作用和机制。
方法水蒸气蒸馏法和乙醇提取上大孔吸附树脂柱精制法提取丹皮酚和丹皮总苷。
制备含药血清。
采用H202诱导损伤H U V E C,与丹皮酚、丹皮总苷含药血清共培养后，M T T法检测细胞存活率；微板法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（L D H)、内皮素-1 ( E T - 1 )和一氧化氮（N O)的含量；流式细胞术检测细胞;周亡率；W e s t e r n B l o t法测定B a x、B e l -2蛋 白表达水平。
结果与空白组比较,模型组细胞的L D H、E T-1含量均有显著提高（P <0.01),而N O含量显著降低（P< 0.01);与模型组比较，丹皮总苷、丹皮酚、联合给药组的细胞存活率明显提高（P<0.05或P <0.01 )且细胞凋亡减少；丹 皮总苷、丹皮酚及联合给药组的I.D H含量显著降低（f<0. 01或P<0. 05);丹皮总苷、联合给药组N O含量显著提高(P<0.01);丹皮总苷、联合给药组E T-1含量显著降低（P<0.05或P<0.01)。
丹皮总普、丹皮酚、联合给药组均能下调B a x蛋白、上调B c l-2蛋白表达水平（P<0.05或P<0.01)。
