实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养

人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定权燕;郑练【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2009(22)4【摘要】目的:寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养方法。

方法:在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。

结果:改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈"铺路石"状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。

结论:本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。

【总页数】4页(P209-211)【关键词】人脐静脉;内皮细胞;细胞培养;分离;鉴定【作者】权燕;郑练【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院小儿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术 [J], 吴金义;张蕾;张秀英;曲丽梅2.人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达 [J], 吴世卿;郑俊发;曾曙光;陈少鹏;薛国初;章锦才3.人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定 [J], 林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波4.人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 牛成伟;曹凯5.人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定 [J], 阮溦;李锁北;戴如平;徐军美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。

方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。

结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。

内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。

结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。

[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。

huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验是一种常用的细胞实验方法，旨在研究人体血管内皮细胞（HUVEC）在体外形成管状结构的能力。

本文将介绍HUVEC小管生成实验的整体流程和关键步骤。

一、实验前准备在进行HUVEC小管生成实验之前，需要准备以下实验材料和设备：1. HUVEC细胞系：HUVEC细胞系是由人体血管内皮细胞培养而成的细胞株，可通过购买或实验室培养获得。

2. 培养基：HUVEC细胞的培养基通常为含有生长因子和营养物质的培养基，如EGM-2培养基。

3. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。

4. 细胞培养条件：实验室内需要提供恒温恒湿的培养箱，并保持细胞培养条件稳定。

二、实验步骤1. HUVEC细胞的处理将培养好的HUVEC细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基中的残留物。

然后加入胰酶等胰蛋白酶类物质，使细胞与培养瓶底分离，放置一段时间，使细胞形成单细胞悬浮液。

2. 细胞计数和制备细胞悬液用显微镜和细胞计数板对HUVEC细胞进行计数，以确定细胞的浓度。

根据所需实验的细胞密度，将细胞悬液稀释至适当浓度。

3. 细胞培养和形成小管将稀释后的HUVEC细胞悬液均匀地加入预先涂覆有基质（如Matrigel）的培养皿中，使细胞悬液均匀分布。

然后将培养皿置于培养箱中，保持适宜的温度和湿度进行培养。

在一定时间后，通过显微镜观察细胞是否形成管状结构。

4. 小管形成的评估使用显微镜观察和拍摄HUVEC细胞形成的小管结构，并记录相关数据。

可以通过图像处理软件对小管网络的形态参数进行分析，如长度、分支数等。

5. 对实验结果的统计分析根据实验数据，使用统计学方法（如t检验、方差分析等）对不同处理组的小管生成能力进行比较和分析，以获得可靠的实验结果。

三、实验注意事项1. HUVEC细胞的培养条件和培养基的配方需要根据实验目的和相关文献进行优化选择。

2. 在实验过程中应注意细胞的无菌操作，避免细胞受到污染。

在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究张又枝;黄琦;任平【摘要】目的建立一种在特殊材料Transwell培养小室中分离培养原代人脐静脉内皮细胞的技术.方法采用酶消化法分离得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC),免疫荧光法检测内皮因子Ⅷ予以鉴定,待长满后用不含EDTA的0.25％胰酶传代到Transwell小室中,观察小室中HUVEC的生长情况.结果在脐带长度一定的情况下,HUVEC分离所得到细胞的多少以及细胞的状态与胰酶的用量、时间、温度及是否含EDTA关系密切.本研究胰酶消化时间在室温(25℃左右)情况下要消化30min,用的胰酶是含EDTA和不含EDTA的胰酶1∶1混合;长满之后传代消化的胰酶只能用不含EDTA的胰酶消化,时间以在镜下的细胞状态为准.结论在特殊材料Transwell小室中成功分离培养HUVEC,一定要在比较温和的条件下消化HUVEC,这样才可能得到活力比较好、数量比较多的细胞.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2015(029)002【总页数】3页(P96-97,103)【关键词】人脐静脉内皮细胞;Transwell小室;胰酶【作者】张又枝;黄琦;任平【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病及心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100【正文语种】中文【中图分类】R329.3人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在医药学的基础研究中应用广泛，主要是其比较易得到，而且又具有内皮细胞的特征，对疾病的发病机制的研究极为重要。

但是该细胞比较脆弱，极易损伤，在研究中不易得到活力比较好的细胞。

Transwell 小室是一种嵌入细胞培养板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦称为PET 膜，该膜根据孔径不同将其分为不同种的小室，但是共有的特点是其具有通透性，使小室内外培养液的成分相互影响，从而影响细胞的生长、运动等。

huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。

HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。

本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。

材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。

2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。

3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。

4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。

5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。

实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。

b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。

c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。

d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。

2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。

b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。

c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。

3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。

b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。

c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。

4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。

b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。

5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。

b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。

结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。

实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。

小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。

此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。

HUVEC原代培养方案1 实验材料1.1实验器材广口瓶（250ml）1个，注射器（30ml,20ml各2个），灌胃针头3个，止血钳3把，离心管（10ml）4根，铝饭盒1个，烧杯4个，橡胶塞4个，细胞培养箱，莱卡倒置显微镜。

1.2实验试剂I型胶原酶（Gibco 批号：1344183），PBS 自制，M199（Sigma lot No 083K83581），胎牛血清（Gibco）2 实验方法1）从无菌的广口瓶中取出新生脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉，在脐静脉的一端插入带钝头的灌胃针，用止血钳固定。

2）30ml注射器吸取温PBS后接灌胃针头，反复冲洗至流出的液体无色。

3）冲洗干净后，挤压去掉脐静脉内的PBS，另一端插入灌胃针头并用止血钳固定。

4）向脐静脉内注入0.1%的I型胶原酶，使之充盈，用橡胶塞封闭两端的灌胃针头，再将脐带放入37度孵箱中温育适当时间并不时摇动以促进消化。

5）无菌条件下取出脐带，取出橡胶塞，将含有内皮细胞的胶原酶液注入10ml的锥形离心管中。

6）用止血钳轻轻挤压脐静脉管壁后，再用20ml注射器吸取PBS冲洗，流出液一并收集于10ml的离心管中。

7）1200RPM离心10分钟，弃上清，加入完全培养基，充分混合制成细胞悬液。

3 注意事项1）实验前准备充分，取脐带时一定要注意无菌。

2）实验时不要说话，注意无菌操作，并且要规范。

3）把握好胶原酶消化时间，不同批次胶原酶活性不一样，消化能力不一样，所以换酶时需要重新掌握好消化时间。

试剂配制：1）I型胶原酶溶液称取I型胶原酶适量，用PBS配制成浓度为0.1%的溶液，过滤后分装，-20℃保存，临用时融化并预热。

2）M199培养液M199 9.8g 青霉素 60mg链霉素 100mg 碳酸氢钠 2.2g肝素 50mg 谷氨酰胺 293.2mg共配成1000ml 过滤后放冰箱备用。

HUVEC培养过程（Human Umbilical V ein Endothelial Cells）1.细胞名称：人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells）2.购买公司：Cascade Biologics （Invitrogen公司），Catalog Number: C-023-5C；3.试剂及培养液配制注：此处所用TTrypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution为培养HUVEC细胞用专有的消化、中和液，切勿用其他代替。

M200+LSGS：4.培养过程（简略）HUVEC为原代细胞，除复苏、冻存过程中与常规细胞系如293T等贴壁细胞雷同外，需主要注意的是培养液放置温度、Trypsin消化细胞过程。

1）培养液放置温度：细胞代理销售公司技术推荐在使用前30min室温（25-27℃）中放置配制好的培养液，用脸贴培养瓶而感觉到不冷（即接近人体温）即可使用。

Trypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution可同样处置。

2）Trypsin消化细胞过程：加入4mL Trypsin/EDTA solution/ 25cm2 flask后晃动3次，吸弃3mL Trypsin/EDTA，室温中作用1-3mins，显微镜下观察细胞变圆、脱离培养皿即可加入3mL Trypsin Neutralizer solution进行终止作用。

3）转移细胞至15mL离心管中，1000rpm 离心5mins，弃上清，加入新鲜的培养液转移至新的培养皿/瓶。

4）复苏、冻存雷同其他细胞操作，细胞复苏、传代后不可多次传代，一次复苏的细胞尽量满足连续性试验需要。

5）可参考Cascade Biologics公司的操作。

原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结刘文;陈瑞云;王志伟【摘要】目的建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法.方法采用0.125％胰酶+0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定.结果原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论 0.125％胰酶+0.01％EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2016(024)008【总页数】3页(P11-13)【关键词】原代人脐静脉内皮细胞;分离;细胞培养【作者】刘文;陈瑞云;王志伟【作者单位】山东省青岛科技大学校医院内科,山东青岛266044;山东省青岛大学第二附属医院胃肠外科,山东青岛266042;山东省青岛大学第二附属医院肛肠外科,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q813.11血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是血管内表面的单层扁平上皮，构成了血管壁与血液之间的机械屏障，EC能吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，能分泌很多生物活性物质以调节血管通透性、参与凝血和动脉粥样硬化过程，还能通过调节血管的收缩和舒张以调节血压等。

为研究人体大血管内皮功能需要体外建立人血管内皮细胞模型，而内皮细胞株ECV304,在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞存在明显差异[1]，因此，体外分离培养原代人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是获取内皮细胞的重要途径。

本实验总结了体外培养HUVECs的方法，应用消化酶灌注法,成功分离了人脐静脉内皮细胞，获取了大量的HUVECs，创建了研究内皮细胞的模型。

1 材料与方法1.1 标本来源脐带均来自于剖宫产的新生儿脐带，于无菌条件下获取，迅速转移至细胞室超净台中，进行分离培养。

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。

）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。

2000转/分，离心3分钟。

12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。

实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。

实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 每2-3天更换一次培养基。

3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。

二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。

2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。

3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。

三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。

2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。

3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。

四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。

2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。

3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。

五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。

2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。

3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。

实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。

二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。

三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。

huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的细胞模型，在很多生物医学研究中被广泛应用。

正确认识和鉴定HUVEC细胞的方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。

然而，由于其细胞特性的多样性和相似性，准确地鉴定HUVEC细胞一直是一个具有挑战性的课题。

目前，主要的HUVEC细胞鉴定方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等。

形态学观察是最直观的方法，通过观察细胞的形态、大小、颜色等特征来初步鉴定。

然而，形态学观察仅仅是最初的鉴定步骤，无法提供确凿的证据。

免疫细胞化学染色是一种常用的鉴定方法，通过使用特异性的抗体标记HUVEC细胞所表达的特定蛋白，如血管内皮细胞相关抗原（CD31）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM-1）等。

这种方法能够在细胞水平上确定细胞的身份，并且具有较高的特异性和敏感性。

另外，遗传学分析也是一种重要的HUVEC细胞鉴定方法。

通过检测HUVEC细胞中特定基因的表达情况或突变情况，如内皮细胞特异性基因（von Willebrand因子、血管内皮生长因子等）的表达，或特定突变基因（如朊病毒受体Eynoltin-2的突变）等，可以进一步确定细胞的身份。

综上所述，准确鉴定HUVEC细胞的方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等多种方法的综合应用。

在进行HUVEC细胞相关研究时，应充分考虑综合运用这些方法来确保实验结果的准确性和可靠性。

未来的研究可以进一步改进和发展更加精确、高效的HUVEC细胞鉴定方法，以满足不断深入的实验需求。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在向读者介绍本篇文章的整体结构，以帮助读者更好地理解和阅读文章。

本文分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分包括概述、文章结构和目的三个方面。

在概述中，将简要介绍HUVEC细胞的重要性和研究价值。

文章结构部分将向读者展示本文的整体框架，以便读者在阅读过程中能够有条不紊地理解文章内容。

人脐静脉内皮细胞培养1 材料1.1 取材新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的PBS，并加上200 U/ml 青链霉素)，产后4 h 内最佳，一定不要超过24 h，实验前保存在4℃冰箱中。

1.2 试剂0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199 均可)；培养液(M199、50 μg/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmol⋅L-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。

平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks’液)；1%明胶。

1.3 器械烧杯(脐带数＋2)、止血钳(脐带数×2＋2)、镊子2 把、手术直剪(脐带数×1)、12 号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数×1)、玻璃培养皿。

2 方法2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2 ml培养液(含10%血清的普通培养液)冲洗培养瓶一遍，放置超净台中。

2.2 去妇产科取当天新鲜脐带。

2.3 将取出的脐带放在盛有含双抗PBS 的玻璃培养皿中，洗净脐带表面的残留血液，将脐带两端各剪去一部分；更换一个新的玻璃培养皿，辨别脐带静脉(粗大的那根)，顺着静脉插入大针头，注入含双抗PBS，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液；再更换一个培养皿，加少许PBS，把脐带放在培养皿中，从针头打入胶原酶(37℃预温)，当胶原酶从另一头流出少许的时候，用止血钳夹闭，继续注入胶原酶使脐带充盈后也封闭，37℃消化15 min(室温30℃ 20 min)。

消化结束后收集所有消化液，吸取PBS 冲洗脐带，合并到消化液中，1000 rpm 离心5 min，弃上清，加入4 ml 培养液悬浮细胞，接种到明胶包被的塑料培养瓶中，12-24 h 后换液一次。

一般一根脐带消化下来的细胞可以培养一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔，细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。

2.4 3-4 天长满后用胰酶(含EDTA)消化以1:2 传代时。

一、实验目的本研究旨在探讨血管生成诱导剂在促进血管新生方面的作用及其分子机制。

通过体外培养血管内皮细胞和体内动物模型，观察血管生成诱导剂对血管新生的影响，并进一步分析其作用机制。

二、实验材料与方法1. 实验材料- 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）- 血管生成诱导剂：VEGF、bFGF、FGF-2等- 体外培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、抗生素等- 体内动物模型：大鼠- 实验仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、分光光度计等2. 实验方法1. 体外培养血管内皮细胞- 将HUVECs接种于6孔板，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

- 当细胞生长至80%融合时，用含不同浓度血管生成诱导剂的培养基替换原培养基，继续培养24小时。

2. 观察血管生成- 将培养好的细胞用台盼蓝染色，在倒置显微镜下观察血管生成情况。

- 使用图像分析软件对血管生成进行定量分析。

3. 体内动物模型- 将大鼠随机分为实验组和对照组，实验组给予血管生成诱导剂，对照组给予生理盐水。

- 观察动物的一般情况，记录体重变化。

- 在实验结束时，取动物心脏，用TTC染色法检测心肌梗死面积。

4. 分子机制分析- 采用RT-PCR检测心肌HIF-1、VEGF、eNOS mRNA的表达。

- 采用Western Blot检测心肌eNOS、iNOS、AKT、p-AKT蛋白表达。

- 采用分光光度法检测血清NO水平。

三、实验结果1. 体外实验- 血管生成诱导剂能显著促进HUVECs的血管生成。

- 不同浓度的血管生成诱导剂对血管生成的影响存在差异，其中VEGF和bFGF 的效果最为显著。

2. 体内实验- 与对照组相比，实验组大鼠的心肌梗死面积明显减小。

- 实验组大鼠的心肌HIF-1、VEGF、eNOS mRNA表达水平显著升高。

- 实验组大鼠的心肌eNOS、AKT、p-AKT蛋白表达水平显著升高。

- 实验组大鼠的血清NO水平显著升高。

huvec细胞成管原理HUVEC细胞成管原理主要涉及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在体外形成管腔结构的过程。

HUVEC细胞是一种源自人体脐静脉内皮的细胞，常被用于体外实验研究。

成管过程是指HUVEC细胞在特定条件下形成管状结构，模拟人体内血管系统的形成。

成管的过程经历几个主要阶段。

首先，HUVEC细胞被培养在含有特定细胞培养基的培养皿中。

接着，经过一定时间的培养，HUVEC细胞开始发生形态改变，从扁平的形态转变为柱状形态。

这个阶段被称为上皮细胞向内突出。

细胞内的特定信号逐渐调节细胞的粘附性，促使细胞集结在一起。

接下来，HUVEC细胞开始形成单层的圆形管腔结构。

这是通过细胞间的细胞黏附分子和细胞外基质分子之间的相互作用实现的。

这些分子在特定时间和位置上被调控，从而使细胞形成管状结构。

同时，细胞内的信号通路被激活，导致细胞内的分化和生长。

最后，一系列的信号通路和细胞间相互作用促使管腔的进一步扩张和稳定。

这个过程涉及到细胞分化和新的基质分子的合成和分泌。

细胞继续增殖、迁移并形成分支，最终形成完整的管腔结构。

HUVEC细胞成管的研究对于了解血管系统的形成和发展具有重要意义。

这种体外实验方法可以帮助科学家们研究和理解细胞间的相互作用、信号通路的调控以及基质的重要性。

通过研究HUVEC细胞成管原理，我们可以更好地了解血管疾病的发生机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

总而言之，HUVEC细胞成管原理是关于人脐静脉内皮细胞在体外形成管腔结构的过程。

这一过程涉及到细胞的形态改变、信号通路的调控以及细胞间和细胞与基质之间的相互作用。

研究HUVEC细胞成管原理有助于我们更好地理解血管系统的形成和发展，并为血管相关疾病的治疗提供新的方向。

细胞说明书（HUVEC）
细胞名称：HUVEC（中文名称：人脐静脉内皮细胞）
细胞简介：HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，来源于人脐静脉，中文名为人脐静脉内皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。

培养方法：
冻存方法：
For research use only
T25瓶细胞处理方法
收到细胞后，检查外包装是否完整，细胞培养瓶是否完好。

如有破损漏液等问题，请即时联系
我们。

1.75%酒精棉球擦拭T25细胞培养瓶外部。

2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（40
×,100×,200×各一张）。

3.将细胞放入37度培养箱中预温1-2小时后再做处理，以稳定细胞状态。

4.预热培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）。

5.若细胞密度较小，无菌操作，去掉培养基。

每瓶添加第四步中准备的5-6ml培养基。

放
到37度培养箱培养。

待细胞密度达到80%以上，进行传代。

6.若细胞密度较大，达到80%以上，将细胞传到10cm培养皿培养。

7.传代时，T25瓶里保留部分细胞，同步培养，直到能确保10cm培养皿中的细胞状态良
好。

两种人脐静脉内皮细胞培养方法的比较目的：用两种不同的方法培养人脐静脉内皮细胞，比较两种方法的优缺点。

方法：（1）方法1，用0.125%胰酶加0.02%的EDTA消化液消化、方离脐静脉内皮细胞，用含20%的胎牛血清的DMEM完全培养液，于37 ℃、5% CO2条件下培养。

（2）方法2，用胶原酶Ⅱ消化脐静脉内皮细胞，用含20%胎牛血清+细胞生长因子+明胶铺板，于37 ℃、5% CO2条件下培养。

比较两种方法对细胞活力、培养细胞数量等方面的影响。

结果：以改良方法培养的内皮细胞4 h贴壁生长，细胞数量达到整瓶的80%～90%，48～72 h生长最快，细胞融合，内皮细胞呈单层铺路石样外观。

传统方法培养的内皮细胞24 h后细胞数量只达到整瓶的20%～30%，细胞融合较慢。

结论：用0.125%胰酶加0.02%的EDTA灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，更加简便、经济，是建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的好方法。

标签：人脐静脉内皮细胞；消化液；培养方法人脐静脉内皮细胞为位于血管内壁与血液直接接触的单层细胞。

内皮功能失常可破坏血管壁凝血和循环功能障碍，与多种疾病发生密切相关，血管细胞的研究因此成为动脉粥样硬化以及其他血管疾病研究的重要方向[1-2]。

人们常用脐静脉作为获取血管内皮细胞的来源。

本研究利用健康婴儿脐带，分别采用改良方法和传统方法来获取内皮细胞，结果发现细胞数量和细胞活力都出现不同的效果。

1 材料与方法1.1 实验材料及主要试剂、仪器1.1.1 材料足月健康出生的新生儿脐带由太和医院妇产科提供，产妇及其家属签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂M199培养基，胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶，EDTA （国产，武汉天源生物技术有限公司），胶原酶Ⅱ（Amresco公司）1.1.3 仪器倒置显微镜（Olympus公司，日本），恒温恒湿培养箱（Thermo 公司，美国）1.2 实验方法HUVECs的原代培养：无菌条件下取新生儿脐带两根（离体时间6 h以内），长度至少15～20 cm，在超净工作台内剪去脐带两端易污染及血肿部分，找到脐静脉后，净尖端已磨平的50 ml注射器针头插入脐静脉一端的管腔中，用止血钳夹闭固定针头，用37 ℃预热的PBS冲洗脐静脉管腔2遍，将脐静脉内的血液冲洗至无色。

《丹皮酚（Pae）对高脂血清损伤人内皮细胞的保护作用及其分子机制》篇一一、引言近年来，心血管疾病已经成为全球范围内严重威胁人类健康的疾病之一。

其中，高脂血症引起的内皮细胞损伤是心血管疾病发生发展的重要因素之一。

丹皮酚（Pae）是一种从牡丹皮中提取的天然活性成分，具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。

近年来，关于丹皮酚对高脂血清损伤人内皮细胞的保护作用及其分子机制的研究逐渐成为热点。

本文旨在探讨丹皮酚对高脂血清损伤人内皮细胞的保护作用及其可能的分子机制。

二、材料与方法1. 材料（1）细胞：人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（2）药物：丹皮酚（3）试剂与仪器：高脂血清、DMEM培养基、MTT试剂、流式细胞仪、荧光显微镜等。

2. 方法（1）细胞培养与处理：将HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，分为正常对照组、高脂血清损伤组和丹皮酚处理组。

（2）细胞活力检测：采用MTT法检测细胞活力。

（3）流式细胞术检测细胞凋亡：利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

（4）荧光显微镜观察细胞形态：利用荧光显微镜观察各组细胞形态变化。

（5）分子机制研究：通过PCR、Western Blot等技术研究相关基因和蛋白的表达情况。

三、结果1. 丹皮酚对高脂血清损伤人内皮细胞的保护作用（1）细胞活力检测结果显示，高脂血清处理后，HUVEC细胞活力显著降低，而加入丹皮酚处理后，细胞活力得到显著提高。

（2）流式细胞术检测结果显示，高脂血清处理后，HUVEC 细胞凋亡率显著升高，而加入丹皮酚处理后，细胞凋亡率得到显著降低。

2. 分子机制研究（1）PCR结果显示，丹皮酚处理后，相关抗炎、抗氧化基因的表达水平得到显著提高，如Nrf2、HO-1等。

（2）Western Blot结果显示，丹皮酚处理后，相关抗凋亡蛋白的表达水平得到显著提高，如Bcl-2等；而促凋亡蛋白的表达水平则显著降低，如Caspase-3等。

四、讨论根据实验结果，我们可以得出以下结论：丹皮酚对高脂血清损伤人内皮细胞具有显著的保护作用，其机制可能与提高抗炎、抗氧化基因的表达水平以及提高抗凋亡蛋白的表达水平有关。