SV40T转化人脐静脉内皮细胞贴壁培养

本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。

方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。

结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。

内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。

结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。

[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。

自然发生的调节性t细胞naturalregulatorycellntregcd4在维持自身耐受方面发挥了重要作用reg在细胞活化阶段以抗原非特异性形式通过下调对自身或非自身抗原免疫反应来维持自身耐受其介导的外周耐受机制异常可能是各种自身免疫性疾病和哮喘等变态反应性疾病发生的重要原因
医学综述 2010 年 2月第 16 卷第 3期 M edical R ecapitu late , Feb 2010 , V o. l 16, N o . 3 287 294. M ik i T, S trom SC. Am n ion derived p lu ripotent /mu lt ipotent stem cells[ J]. S tem C ell R ev, 2006 , 2 ( 2) : 133 142 . Tam agaw a T, Ish iwata I , Saito S. E stab lishm ent and characterization of a p luripoten t stem cell lin e derived from hum an am n iotic m em b ranes and in itiat ion of ger m layers in vitro[ J] . Hum Cel, l 2004 , 17( 3) : 125 130. Saku ragaw a N, Thangavel R, M izugu chi M , et al. Exp ression of m arkers for both n euron al and glial cells in hum an amn iot ic ep ith e lial cells[ J] . N eu rosci Let t , 1996 , 209 ( 1) : 9 12 . Saku ragaw a N, M isaw aH, O h sug iK, e t al. Ev idence for act ive ace ty lchol ine m etabol ism in hum an am n iot ic ep ithelial cells : A ppl ica b le to intracereb ral allograft ing for neuro log ic d isease[ J] . N eu rosci Lett , 1997 , 232 ( 1) : 53 56 . El w an M A, Saku ragaw a N. Ev idence for synthes is and release of catecholam in es by hum an amn iot ic ep ithelial cells [ J ] . N eurore port , 1997 , 8( 16) : 3435 3438 . El w an M A, Thangavel R, O no F, et al. Syn thesis and release of catecholam in es by cu ltu red monk ey am n iotic epithelial cells[ J] . J N eurosci R es , 1998 , 53( 1 ) : 107 113 . K ak ish ita K, E l w an M A, N akao N, et a l . Hu m an amn iotic epithelial cells produce dopam ine and survive after m i p lan tation in to the striatum of a rat model of Park inson s disease : A potent ial source of donor for tran sp lantation th erapy[ J] . Exp N eu ro, l 2000 , 165 ( 1) : 27 34 . K ak ish ita K, N akao N, S akuragaw a N, e t al. I m p lan tat ion of human amn iot ic ep ithelial cell p reven ts the degeneration of n igral dopa m ine neu rons in rats w ith 6 hyd roxydopam ine les ion s [ J] . B rain R es , 2003, 980( 1) : 48 56. Saku ragaw a N, Enosaw a S, Ish ii T, et al. H um an amn iot ic ep ith elial cells are p rom is ing t ransgen e carriers for allogen eic cell tran sp lan tat ion in to l iver[ J] . J H um G enet , 2000 , 45( 3 ): 171 176 . Takash i ma S , IseH, Zh ao P, et al. H um an am n iotic ep ith elial cells possess hep atocyte like characteristics and functions [ J ] . C ell S truct Fun ct , 2004, 29( 3) : 73 84. D avila JC, C ezar G G, Th ied eM, e t a l . U se and app lication of stem cells in tox icology[ J] . Toxicol Sc, i 2004 , 79( 2 ): 214 223 . W ei JP, Zhang TS , K aw a S, et a l . Hum an amn ion isolated cells nor m alize b lood glucose in s treptozotocin indu ced d iabetic m ice [ J] . Cel l Transplant , 2003 , 12 ( 5) : 545 552 . Port m ann Lanz CB , Schoeberlein A, H uber A, et a l . P lacen tal m es enchym al s tem cells as potent ial au tologous graft for pre and per i natal neu roregeneration[ J] . Am J O bstet G yneco, l 2006 , 194( 3) : 664 673. [ 21]

综上所述，本研究的人脐静脉内皮细胞分离、培养、 鉴定的方法简捷易行，成功率较高，能获得大量内皮细 胞，能很好地满足实验研究的需要。 【参考文献】 ［１］ Mallika V,Goswami B,Rajappa M.Atherosclerosis patho-
physiology and the role of novel risk factors:a
静脉通道，遇到病情变化可随时用药，为抢救患者生命
2 方法
赢得了宝贵的时间。
2.1 材料选用 套管针采用洁瑞公司生产的封闭式套 3.3 套管针的穿刺部位均为静脉远端，近邻无重要脏
管针，型号为２０Ｇ或２２Ｇ；敷料采用３Ｌ公司９ｃｍ×６ｃｍ的无 器组织，从而避免了深静脉穿刺的并发症。
菌透明敷贴。
4 使用套管针的注意事项
静脉套管针作为一项新的护理技术已广泛应用于 套管，放松止血带，拔出针芯，用无菌透明敷贴固定套管
临床，特别在急危患者的抢救中更为重要，它保持了静 针，调节输液速度。
脉管道的持续畅通。在Ｃ Ｃ Ｕ 的工作中常常遇到以下情 3 使用套管针的优越性
况：急性心肌梗死的患者由于剧烈的胸痛和恶心呕吐导 3.1 套管针针体长，外套管柔软远端圆滑而整齐，留
1 临床资料
体外渗的发生，对急性心肌梗死的患者静脉具有保护作
我院自２００８．１－２００９．４应用静脉套管针技术抢救急 用，套管针可以留置５－７ｄ［２］。对于需要反复多次静脉输液
性心肌梗死患者１００例，其中男６８例，女３２例；年龄２９－８６ 及随时需要输液的患者，套管针的留置等于一条开放的
岁，平均６ ７ ． ４ 岁。
·６０·
承 德 医 学 院 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＥＮＧＤＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。

注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。

6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。

）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。

2000转/分，离心3分钟。

12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。

人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会杜利君;蒋兴亮【摘要】目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法.方法:采用0.1％ IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20％胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原.结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列.免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础.【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养【作者】杜利君;蒋兴亮【作者单位】川北医学院附属医院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】R329.2体外建立人血管内皮细胞模型是研究人体大血管内皮功能的主要手段之一。

由于内皮细胞株ECV304在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞比较存在明显差异［1］，因此，体外分离和原代培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)已成为国内外学者获取内皮细胞的重要途径。

本实验在借鉴其他学者体外分离、培养HUVECs技术的基础上，通过大量的实验并对此加以改良，旨在建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的HUVECs的分离、培养方法，为进一步研究血管内皮细胞的功能及阐明相关疾病的生理和病理机制奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料M199培养液和胎牛血清分别为Invitrogen公司和Hyclone公司产品，IV型胶原酶、内皮细胞生长因子(ECGS)、肝素钠均为Sigma公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔IgG抗体为北京中杉金桥公司产品，青霉素和链霉素为华北制药股份有限公司产品。

ｓｎ ｔ １ ．Ｄｅａｔ ｎ ａｄｏ ｇ ，Ｔ ｅ ６ ｏ ｉ ｌｆＰ Ａ ｈｎ ｄ ｅｅ０ ７０ Ｃ ｉ ２ ｅｔ ｌ ｔｉ ｕｐｙＤｅａ ｍ ｎ，Ｔ ｅ ｏｇ ，ｅａ．１ ｐ ｒ ｔｆＣ ｒｉｏｙ ｈ ６Ｈ ｓ ｔ Ｌ ，Ｃ ｅｇ ｅ ｂｉ ６ ００， ｈｎ ｍｅ ｏ ｌ ２ ｐａ ｏ Ｈ ａ； ．Ｃｎｒ ｅｌ Ｓｐｌ ｐ ｒ ｅｔ ｈ ａ Ｃ ｒｅ ｔ Ａｆａｅ ｏ ｉ ｌ Ｃ ｅｇ ｅ ｄ ａ ｏ ｅｅ Ｃ ｅｇ ｅ ｅｅ０ ７ ０ ， ｈｎ ；．Ｄｐ ｒ ｅｔｆＣ ｒｉｏｙ Ｓｃｎ Ｈ ｓｉ ｌｆＴａｆ ｆ ｌｔ ｉ ｄＨ ｓ ｔ ｏ ｈｎ ｄ Ｍｅｉ ｌ ｌｇ ， ｈｎ ｄ Ｈ ｂｉ ６ ０ ０ Ｃ ｉ ３ ｅａ ｍ ｎ ａｄｏ ｇ ， ｅｏ ｐ ａｆ ｃ Ｃｌ ａ ｔ ｏ ｌ ｄ ｏ ｔ ｉｉ ｐ ａｏ ｎ ｎＭｅｉ ｌ － ｄｃ ａＵ
Ｐ Ｙ．ａ ｄｔｅｅ ａ ｎ ｔ ｎｗｉ ｎｉｅ ｓｏ ｕ ｎ Ⅷ ｆｃｏ ｓｐ ｓ ｉｅ ｎ ｈ ｘ ｍｉａｉ ｔ ａ ｔ ｎ ｆｈ ｍａ ｏ ｈ ｇ ａｔｒｗａ ｏ ｉｖ ．Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐｅｆ ｓｏ ｔ ｐｅＩ ｏｌｇｎ ｓ ｎｅｆｃｉｅｗａ ｏｃｌｅｔ ｔ ｎ ｌｓｏ ｒｕ ｉｎｗｉ ｔ ｌ ｅ ａ ｅｉ ａ ｆｅ ｔ ｙｔ ｏｌｃ ｈｙ ｃ ａ ｓ ｖ
ＪｕｎｌｆＣｉｉ ｌ ｎ ｘｅｍｅｔｌ ｄｃ ｅＶ１１ ， ｏ １ Ｓｐ ２ １ ｏ ｒａ ｌ ｃ ｄＥ ｐｒ ｎａ ｉｎ ｏ． １ Ｎ ． ８ ｅ．０ ２ ｏ ｎａａ ｉ Ｍｅ ｉ
人 脐 静 脉 内皮胞 细体 外 培 养及 鉴 定
李 东升 邵 素玲 杨 万松 黄 体钢 １解放 军 ２ ６医院心 内科 河 北 承德 （ ６ ２承德 医学 院附属 医院 消毒 供应 中心 河 北 ３天 医科 大 学第二 医院心脏 科 天津 承德 ０７０ ６００； ３０ １ ） ０２ １

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。

建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。

方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液，一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。

收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。

并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。

用流式细胞术观察细胞周期。

结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。

细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。

结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。

内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。

新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。

原代人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进与鉴定摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞（HUVECs）原代培养的方法，为体外研究血管内皮细胞功能提供实验基础。

方法取健康剖宫产新生儿脐带15-20cm，2h内用0.1%II型胶原酶37℃孵育12min得细胞，用改良M199培养液于37℃，5%CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞形态特点，免疫组织化学染色进行细胞鉴定，管腔形成实验观察细胞传代后小管形成能力变化。

结果采用0.1%II型胶原酶灌注法及改良培养基可相当数量、细胞形态良好的HUVECs，利用Ⅷ因子相关抗原进行鉴定得到纯度大于99%，且传代后管腔形成能力与原代细胞无差别（P<0.05）。

结论用0.1%II型胶原酶分离方法和改良的M199培养基可得到数量多、形态好、功能稳定的人脐静脉内皮细胞，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

【关键词】人脐静脉内皮细胞细胞培养分离鉴定【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）28-0017-02内皮细胞功能紊乱参与了动脉粥样硬化、高血压、糖尿病微血管病变等多种心血管疾病复杂的病理机制中，因此研究血管内皮细胞的功能变化成为了研究心血管疾病的重要方向[1]。

体外成功建立内皮细胞模型依赖于获取高质量的内皮细胞，人脐静脉为内皮细胞的主要来源，其具有取材方便，来源较充足和操作简易等特点，但其分离结果受较多因素的影响[2]。

本实验组通过不断摸索，采用II型胶原酶灌注法和改良M199培养液可获得数量较多、细胞纯度高、活性良好的内皮细胞。

1 材料与方法1.1标本来源标本均来自某三甲医院足月健康剖腹产婴儿脐带组织（产妇及其家属签署知情同意书）。

1.2试剂与仪器 M199培养基（Gibco），内皮生长因子（ScienCell)，胎牛血清（Hyclone），Ⅱ型胶原酶（Sigma-Aldric），Matrigel胶（BD），Ⅷ因子相关抗原（武汉博士德），倒置显微镜（日本Olympus）。

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化马振华;张连杰;马艳琴【摘要】为优化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系.分离脐静脉并插管,用0.1％的Ⅱ型胶原酶灌注消化分离内皮细胞.M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5％CO2培养.待细胞铺满80％时,0.25％胰酶-EDTA消化传代培养.倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞.比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响.结果表明,原代培养时,Ⅱ型胶原酶最佳消化时间为15 min,最佳接神密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min.倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列.免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100％.本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(035)003【总页数】5页(P285-289)【关键词】人脐静脉血管内皮细胞;胶原酶消化法;姬姆萨染色;免疫荧光技术【作者】马振华;张连杰;马艳琴【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学山西省环境兽医学重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q813.1血管内皮细胞(endothelial cells,EC)是一种多功能细胞，其在多种疾病中所起的重要作用已越来越受到重视，已成为当今医学、生物学领域的重要研究对象[1]。

人脐静脉 (human umbilical vein，HUV)是培养血管内皮细胞的常用来源之一，与动物血管内皮细胞相比，人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)使实验条件更符合人体情况，结果更有意义[2]。

１ 细胞获取方式
１１ 非酶法：非 酶 法 主 要 包 括 机 械 刮 取、组 织 块 移 植 两 种。
但是机械刮取方法易损伤细胞，组织块移植易混杂其他血管 壁细胞，近几年来这两种方法已较少使用。
１２ 酶消化法：这种方法的主要步骤是用酶灌注脐静脉，收
集内皮细胞后接种培养。每一个过程都影响着 ＨＵＶＥＣｓ的纯 度和活力。消化时间是关系到内皮细胞活力和纯度的重要步 骤，消化时间过长，易混入其他杂细胞，导致内皮细胞自脐静 脉脱离后在培养液中较难存活，使细胞纯度和细胞活力都下 降；反之，消化时 间 过 短，则 获 取 的 细 胞 较 少，经 过 大 量 研 究， 消化时间为 １０～１５ｍｉｎ较为理想［５］。而酶是成功的关键步 骤，早期探索了三种酶处理脐静脉、分离内皮细胞的方法，不 同实验研究表明，不同的酶有不同的优势，用胶原酶消化的细 胞数最多，平均每根脐带可获取（２～５）×１０６ 个细胞，但有时 混杂少量成纤维细胞；链丝菌蛋白酶消化获取的细胞数略少 于胶原酶，但很少混杂成纤维细胞；胰蛋白酶对细胞有毒性作
·９６０·
吉林医学 ２０１８年 ５月第 脉内皮细胞培养技术的研究进展
白雪晶１，冯 磊１，徐文波１，罗 旋１，鄢东海２ （１昆明医科大学第六附属医院，云南省玉溪市人民医院，云南 玉溪 ６５３１００；２昆明医科大学，云南 昆明 ６５０５００）
［关键词］ 人脐静脉；内皮细胞；培养；进展 血管内皮细胞连续覆在血管内膜，其具有重要的生理功 能，广泛参与 了 炎 性 反 应、血 管 新 生、免 疫 应 答、动 脉 粥 样 硬 化、血管张力调节等生理及病理过程［１］。血管内皮细胞功能 失调与许多心血管疾病的发生有关，冠心病的发生与血管内 皮细胞的损伤与其功能异常有密切的关系［２］。内皮细胞的体 外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法， 是目前最简单可靠的被广泛运用于生理研究的人类血管细 胞。随着细胞培养技术不断进步，文献报道了一种仪器，使用 这种仪器内，皮细胞可以从人类的脐静脉中分离出来而不受 污染［３］。但是作为基础实验，笔者仍然需要探索一种适用于 科研工作者的分离纯化 ＨＵＶＥＣｓ的方法。 １９７３年 Ｊａｆｆｅ等首先报道了内皮细胞体外培养的方法［４］， 以后人们在此基础上不断完善和改进，以获得性状稳定、纯度 较高的血管内皮细胞，并可较长时间培养（可传 ６～１０代），内 皮细胞的体外培养关键在于获取、纯化。作为 ＨＵＶＥＣｓ培养 的第一步，细胞的获取方法对细胞纯度及含量至关重要，在培 养细胞的获取方法上，有酶法和非酶法两种。

慢病毒载体介导SV40LT致人脐静脉内皮细胞永生化梁淑丽;聂勇战;吴开春;薛增福;吕艳香;刘洋;梁树辉;殷继鹏;窦维佳;赵晓迪;赵宏喜【摘要】为成功分离与鉴定人原代脐静脉内皮细胞,用猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)异位表达建立永生化人脐静脉内皮细胞系.将含SV40LT cDNA片段的慢病毒载体,转染人原代脐静脉内皮细胞,连续传代培养.通过形态、细胞免疫组织化学、RT-PCR及管状成形试验进行原代及转染后细胞形态学和功能学鉴定及检测SV40大T抗原表达.结果SV40LT转染后的人脐静脉内皮细胞为扁平多角形或短梭状,呈单层铺路石状镶嵌排列.特异性表达Ⅷ因子、KDR、SV40LT表达,并具有营状成型能力.说明成功分离与鉴定永生化的脐静脉内皮细胞系,为后续血管靶向治疗奠定了基础.%To immortalize human umbilical vein endothelial cells( HUVECs) by ectopic expression of Simian Virus 40 Large T ( SV40LT) antigen without malignant transformation. Lentivirus that contained SV40LT cDNA were transfected into the primary HUVECs. Light microscope and scanning electron microscope were used to observe the morphology and growth of the cells . The expression of factor Ⅷ . KDR and SV40LT were detected by immunofluorescence and RT-PCR. Tube formation assay was perfected to verify the functions of the primary HUVECs and the transfected cells. It is resulted that the immortalized cells were homogenous and displayed a characteristic ovoid nucleus. Immunofluorescence staining and RT-PCR showed the immortalized cells specifically expressed Ⅷ factor.KDR andSV40 LT. The transfected cells also keep the ability of tube formation. It is conclused that is identified and immortalized human umbilical vein endothelial cells by SV40 large T for future study.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2011(011)011【总页数】5页(P2423-2427)【关键词】内皮;血管;永生化;细胞;SV40LT【作者】梁淑丽;聂勇战;吴开春;薛增福;吕艳香;刘洋;梁树辉;殷继鹏;窦维佳;赵晓迪;赵宏喜【作者单位】第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;西安市第五医院,西安,710082;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学西京消化病医院,西安,710032;第四军医大学唐都医院妇产科,西安,710038【正文语种】中文【中图分类】R732.2肿瘤的血管靶向治疗一直是肿瘤研究领域的热点,其体外模型多采用原代脐静脉内皮细胞。

人脐静脉内皮细胞的培养方法体外培养的血管内皮细胞已广泛应用于血管疾病、血管修复、肿瘤血管形成等基础研究及临床研究中。

体外培养的血管内皮细胞，仍可保持血管内皮细胞的特征，如表达VIII因子、怀布尔－帕拉德小体(Weibel-Palade body ) 、内皮细胞特异性抗原和IV 型胶原等，还可在三维培养体系或特定诱导条件下形成血管样结构。

体外培养的血管内皮细胞生长形成单层后，会表现出接触抑制和密度限制，将停止生长。

人们已成功培养了牛主动脉内皮、人脐静脉内皮、脑微血管、肺微血管、肝窦微血管及各种肿瘤组织中的血管内皮细胞。

下面小编就来介绍下最常用的人脐静脉血管内皮细胞的培养。

一、材料与设备1. 设备超净工作台、离心机、水浴锅、CO2培养箱、－10℃ 冰箱、－20℃冰箱。

2. 无菌材料大培养皿、止血钳、静脉插管、500ml 大烧杯、消毒的蒸馏水、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、广口试剂瓶、脐带(1根）、保鲜液(0.01% EDTA/DMEM, 4℃储藏）、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青／链霉素、D-Hanks 溶液、I 型胶原酶、VEGF 或ECGS 。

二、操作流程1. 产科无菌取脐带1 根，置于含保鲜液的广口试剂瓶中4℃保存（避免污染），在最短的时间内，将脐带携入实验室，进行以下操作。

2. 在超净工作台或无菌层流工作台上，将脐带用D-Hank 溶液清洗干净，将静脉插管插入脐静脉中，并用丝线结扎、固定。

3. 用20ml 注射器将37℃ 的D-Hanks 溶液注入脐静脉，反复冲洗至清洗液无色澄清为止。

4. 用血管钳夹住脐静脉的另一端，并将0.2％的Ⅰ型或Ⅱ 型胶原酶（约20ml) 通过静脉插管注入脐静脉中，至脐静脉完全充盈为止（排掉静脉管中的空气）。

5. 将脐带放置在盛有37℃水的玻璃烧杯中，在37°C 水浴条件下消化约20min（每5min 抽吸／注入1 次）。

6. 当酶液变成混浊时（在显微镜下可见大量游离细胞），将酶液在脐静脉中反复抽吸冲打3 次后，吸出并置于50ml 离心管中。

人脐静脉内皮细胞培养液的选择
郭梦龙;包小丹;刘巧利;全克玲;井长勤;王文锋
【期刊名称】《河南师范大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】2016(0)5
【摘要】目的:筛选出人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代、传代最适培养液.方
法:0.02%II型胶原酶灌注脐静脉消化15min获得细胞,用不同的培养液培养.24h后观察细胞贴壁状况,细胞计数法得到贴壁细胞数量;内皮细胞标志性蛋白vWF进行细胞鉴定.传代培养后,用MTT法比较不同培养液对HUVECs活力的影响.结果:用含ECGS、20%FBS的ECM组进行原代培养,可获得贴壁细胞数量最多的HUVECs,且与其他组间有显著差异;用含30ng·mL-1 VEGF165、10%FBS的M199进行传代培养,HUVECs活力较ECM组无明显差异.结论:HUVECs原代、传代培养分别选用优化后的培养液,既保证原代HUVECs的质量和数量,又使传代培养成本降低60.8%.【总页数】5页(P112-116)
【关键词】人脐静脉内皮细胞;原代和传代培养;细胞鉴定;培养条件优化
【作者】郭梦龙;包小丹;刘巧利;全克玲;井长勤;王文锋
【作者单位】新乡医学院生命科学技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q256
【相关文献】
1.TRPC6介导DU145细胞条件培养液诱导人脐静脉内皮细胞增殖的研究 [J], 瞿伟;孙刚;王勇;刘屹立;王平
2.肿瘤条件培养液对人脐静脉内皮细胞生长、增殖的影响 [J], 李爱玲; 李宏伟; 王程; 张静; 修瑞娟
3.人脐静脉内皮细胞条件培养液对离体平滑肌细胞增殖的影响 [J], 丛祥凤;张春玲;张英珊
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人脐静脉内皮细胞的原代传代冻存复苏及鉴定人脐静脉内皮细胞的原代培养和传代、冻存、复苏及鉴定1人脐静脉内皮细胞的分离及培养1.1 原代血管内皮细胞的获取与培养在细胞的获取方法上，有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种。

前两种易混杂其他血管壁细胞,近年已逐渐被酶消化法取代。

其中胰蛋白酶灌注法及胶原酶消化法获取原代人脐静脉血管内皮细胞的方法。

1.1.1胰蛋白酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，找到脐静脉。

一端插上带有胶管的玻璃管后结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。

待脐静脉内的残血除净后，用37℃磷酸盐缓冲液(浓度0.01 mol/L，pH=7.6)冲洗2次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8~10 mL，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。

37℃孵育12 min，在此期间经常翻动脐带，使酶溶液在血管内流动，促使内皮细胞与酶均匀接触。

取出脐带轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50 mL锥形离心管中，加入小牛血清2 mL终止酶反应，再以30 mL磷酸盐缓冲液冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000 r/min离心10 min，弃上清(小牛血清及磷酸盐缓冲液)，加入含有10%小牛血清的IMDM培养液，充分混合制成细胞悬液。

取0.1mL 细胞悬液在血细胞计数板计数。

最后调细胞数，以1×105mL接种至24孔培养板中，每孔1mL。

置于5% CO2，37℃静止培养24 h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。

以后每隔2天换液1次，维持细胞的营养和内环境稳定。

1.1.2胶原酶消化法在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝血块阻塞部分，用磷酸盐缓冲液初步清洗，找到脐静脉后，用50 mL注射器吸取磷酸盐缓冲液反复灌注冲洗，洗净残留的血液后用止血钳封住一端，用注射器从另一端灌入15mLⅡ型胶原酶。

超净台内温度一般高于室温，此条件下胶原酶作用15min，期间可不时晃动。

消化完毕打开止血钳，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取1倍于消化液体积的内皮细胞培养基灌洗消化后的血管，收集并与消化液合并，900 r/min离心10min，弃去上清，加入事先孵育至37℃的细胞培养液，吹打均匀。

差速贴壁法体外培养人脐血内皮祖细胞的实验研究李建辉;初少莉;姬开达;李华【期刊名称】《中华高血压杂志》【年(卷),期】2008(16)5【摘要】目的建立一种经济可靠、稳定、高纯度内皮祖细胞的培养方法。

方法采用 Ficoll 密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,于包被人纤连蛋白的培养皿中贴壁培养,收集48 h后的悬浮细胞重新贴壁培养至第7天,利用免疫组化、免疫荧光及流式细胞术对培养的细胞进行鉴定。

结果培养的细胞呈短梭形、多角型、胞体小;可见到大量典型的内皮祖细胞克隆;vWF 和 flk-1免疫组化细胞阳性率>95%,免疫荧光 Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1双染阳性的细胞阳性率>98%,流式分析CD_(133)^+细胞的百分率为(7.0±1.8)%。

结论差速贴壁法是一种经济可靠、稳定、高纯度内皮祖细胞的培养方法。

【总页数】5页(P450-454)【关键词】差速贴壁法;脐血;单个核细胞;内皮祖细胞【作者】李建辉;初少莉;姬开达;李华【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科,上海市高血压研究所,上海200025【正文语种】中文【中图分类】R329.2;R329-33【相关文献】1.体外分阶段共培养法扩增的脐血造血干/祖细胞移植于NOD/SCID小鼠的实验研究 [J], 王金福;项盈;解纯刚;贾冰冰2.差速贴壁法培养大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究 [J], 李辰运;陈剑秋;孙晋津;张晓宇3.体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法:差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法 [J], 殷义霞;李世普;闫玉华;袁琳;王欣宇4.差速贴壁及克隆化培养人胚成肌细胞及其移植恒河猴的实验性研究 [J], 谢建武;黄秀兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人脐静脉内皮细胞的培养观察与鉴定
孙惠文;张梅
【期刊名称】《实用医药杂志》
【年(卷),期】2006(23)9
【摘要】目的探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养、观察及鉴定方法,建立人血管内皮细胞的培养模型,为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段.方法采用终浓度为0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA或0.1%Ⅱ型胶原酶消化、分离脐静脉内皮细胞进行培养,以0.25%胰蛋白酶进行消化传代,并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定.结果原代培养的内皮细胞在接种后约1h开始贴壁生长,5～7d融合成单层.光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列:免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应;电镜下可见胞浆中有W-P小体,证实培养的细胞为内皮细胞.结论用酶灌注消化法消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高.本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型.
【总页数】3页(P1072-1074)
【作者】孙惠文;张梅
【作者单位】山东大学齐鲁医院心内科,山东,济南,250012;山东大学齐鲁医院心内科,山东,济南,250012
【正文语种】中文
【中图分类】Q-33+Q24
【相关文献】
1.人脐静脉内皮细胞的体外培养、鉴定及形态观察 [J], 王立岩;佟晓红;宫桂兰;朱凤全
2.人脐静脉内皮细胞原代培养及鉴定 [J], 阎江洪;吴倩怡;罗素新;夏勇
3.人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察 [J], 朱惠莲;夏敏;唐志红;马静;凌文华
4.三种人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及表面抗原表达比较 [J], 谭小兵;戴青原
5.原代人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定 [J], 罗锐;胡如印;汪健;陆开航
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人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定李东升;邵素玲;杨万松;黄体钢【期刊名称】《临床和实验医学杂志》【年(卷),期】2012(11)18【摘要】Objective To explore the culture method for human umbilical vein endothelial cells( ⅡLVECs ) in vitro. Methods llLVECs were obtained with the treatment of type I collagenase and cultivated in M1640 medium containing 10% FBS and human AB serum. The ECs were identified by immunohistochemical method under inverted microscopy. Results The primary cells began to attach and grow after inoculation for 4 hours, and they grew to monolayer after 5-7 days. They presented as cobble stone - appearance with contact inhibition under inverted microscopy, and the examination with antigens of human Ⅶ factor was positive. Conclusion Perfusion with type 1 collagenase is an effective way to collect ⅡLV ECs in vitro, and it can successfully establish the model of endothelial cells for research.%目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法.方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定.结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5~7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性.结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建.【总页数】2页(P1444-1445)【作者】李东升;邵素玲;杨万松;黄体钢【作者单位】解放军266医院心内科,河北承德,067000;承德医学院附属医院消毒供应中心,河北,承德,067000;天医科大学第二医院心脏科,天津,300211;天医科大学第二医院心脏科,天津,300211【正文语种】中文【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞的体外培养及鉴定 [J], 李曙;徐平;万苏;谢娟娟;张梦莹2.胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞 [J], 白燕慧;张明昌;边芳3.胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞 [J], 白燕慧;张明昌;边芳4.人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察 [J], 朱惠莲;夏敏;唐志红;马静;凌文华5.人脐静脉内皮细胞体外培养与鉴定新方法探索 [J], 牛青霞;何韶衡;陈卓毅;陈韩秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。