实验五、碱性磷酸酶米氏常数的测定

[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
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实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
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5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]

精选课件
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加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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保证每个试管的反应时间为15分钟
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实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
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注意事项
• 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]
• 2 可电脑作图
• 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16)
• 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终 必须得出结论：Km值等于多少
碱性磷酸酶Km值的测定
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1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
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Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
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V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vmax[S]

可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点，
在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作

V Vmax
[S]
Km值的推导
当反应速度为最大反应速度一半时 V
Vmax
Vmax/2 Km [S]
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(LineweaverBurk)作图法
Байду номын сангаас 三、操作方法
参见实验讲义
四、思考题
1.测定Km值还有哪些方法？ 2.测定Km值有何实际意义？
V= Vmax[S]
Km+[S]
两边同取倒数
Km 1/V= + 1/Vmax 1/[S] Vmax （林－贝氏方程）
本实验以碱性磷酸酶为样品： 碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷 酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作 用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物， 根据红色的深浅可测出酶活力的高低，测 定不同浓度底物时的酶活性。
碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物根据红色的深浅可测出酶活力的高低测定不同浓度底物时的酶活性
碱性磷酸酶Km值测定
一、实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响
2.了解米孟方程、Km值的物理意义及双 倒数作图求Km的方法。
二、实验原理