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碱性磷酸酶的活力测定(修改版)汇总.

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碱性磷酸酶活性测定

碱性磷酸酶活性测定

碱性磷酸酶活性测定磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。

试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。

土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。

基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。

应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。

当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。

因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。

这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。

该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。

以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。

血清碱性磷酸酶活力测定

血清碱性磷酸酶活力测定

实验操作
1.取试管4支，按下表操作
测定管 血清（ml） 酚标准液 蒸馏水 pH10碳酸盐缓冲液 0.100 —— —— 1.00 标准管 —— 0.100 —— 1.00 空白管 —— —— 0.100 1.00 对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
1.00
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。

计算 ALP活性=（A测定—A ）/（A —A ） *0.05*100(金氏单位）

酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶 活力单位数，即酶活力浓度。 酶活力的测定方法 1.终止测定法（定时法或终点法） 2.动力学分析法（连续监测法或速率法）

实验目的

熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理

碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基 安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 铁氰化钾


苯酚+4-氨基安替比林红色醌亚胺衍生物源自实验器材和试剂：



（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠 6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 标准品。

血清碱性磷酸酶活力测定

血清碱性磷酸酶活力测定

实验目的
熟悉酶活性测定方法的一般原理 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4 之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基 安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化 ALP 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。 合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热 底物液 1.00 1.00 1.00 1.00
混匀，37℃水浴保护15min 混匀，37℃水浴保护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
磷酸苯二钠+H 磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+ 苯酚+磷酸氢二钠 pH=10 铁氰化钾
苯酚+4苯酚+4-氨基替比林
红色醌亚胺衍生物
实验器材和试剂：
（一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器， 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 （二）试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠 0.1mol/L碳酸盐缓冲液 碳酸盐缓冲液(pH10.0) 6.36g，碳酸氢钠3.36g， 氨基安替比林1.5g，溶于 6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水煮 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4 晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐，在4℃ 冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中） 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g， 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L， 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去) 置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）：购买合格的二级 酚标准工作液（ 05mg/ml）： ）：购买合格的二级 标准品。

8碱性磷酸酶比活力测定

8碱性磷酸酶比活力测定

（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）

碱性磷酸酶检测

碱性磷酸酶检测
合适的辅因子、激活剂浓度
合理的测定时间(?)
最适温度(?)
最适pH (?)
4
5
碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase)
• ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含
量较多，儿童的ALP活性高于成人。 • 临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断. 生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高.
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
1
实验目的
• 熟悉酶活性检测的意义 • 熟悉血清ALP活性测定方法(磷酸苯二钠法) • 掌握血清ALP活性测定的临化学反应的能力，常用单位时间内产物的 生成量(即酶促反应速度)来表示酶活性大小。 • 终止测定法(或定时法): 在酶作用一段时间后，加入强酸、强 碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，
参考值: 成人为3-13个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位
8
讨论
1. 分析各个试管的功用？ 2. 分析公式中各个数值的意义？
3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。
9
K3Fe(CN)6
金氏单位(King’s unit): 在37℃条件下，每100 mL血清与底物作用15分钟，产
生1mg酚的ALP活性为1个金氏单位。
7
实验步骤
T S B C
血清 (mL)
酚标准液 (mL) 蒸馏水 (mL) 碳酸盐缓冲液 (mL) 底物液 (mL)
0.1
— — 1.0 1.0
—
0.1 — 1.0 1.0
—
— 0.1 1.0 1.0
—
— — 1.0 1.0
混匀, 37℃水浴保温5分钟，同时将底物液预热 混匀, 37℃水浴准确保温15分钟

血清碱性磷酸酶活性测定

血清碱性磷酸酶活性测定
保持反应时温度是均衡的37c测定管标准管空白管对照管血清ml0100酚标准液0100蒸馏水0100ph10碳酸盐缓冲液100100100100混匀37水浴保温5min同时将底物预热底物液100100100100混匀37水浴保护15min铁氰化钾溶液300300300300血清0100文档仅供参考不能作为科学依据请勿模仿
血清碱性 磷酸酶活性测 (JIǍN XÌNɡ) 定
————磷酸(LÍN 苯二钠 SUĀN) 法
共十六页
主要 内容： (ZHǓYÀO)
⑴ 实验目的(mùdì)
⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂
⑷ 实验操作
⑸ 计算
共十六页
基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能
力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。 酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
铁氰化钾溶液 血清
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
3.00
3.00
3.00
——
———
——
1.00
3.00 0.100
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取
连续监测法：
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中
某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓 度(nóngdù)的方法。
• 适用于自动生化分析仪
• 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测

实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

VX = 5/6（0.83） VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
有色溶液
设： I IO
T (透光度)
A = lg IO = -lg I = -lg T
I (吸光度)
实验二 碱性磷酸酶的提 取及其比活性测定
材料选择
细胞的破碎
分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
（待测蛋白质含量）
剩余A液
加2ml正丁醇，搅拌 3-5'，室温放置30'， 过滤，入离心管
上述滤液
加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2,
搅拌，记体积VB
B液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验：肝脏
② 生物组织与细胞的破碎
➢ 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ➢ 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎
➢ 反复冻融法 ：
➢ 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而
使细胞破碎
➢ 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞

血清碱性磷酸酶的活性测定

血清碱性磷酸酶的活性测定

实验原理
三.核心原理 ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率 可用分光光度计监测，从而计算ALP活 力的大小 ALP 磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢 PH 10 二钠 苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌 亚胺衍生物

试剂




碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比 林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕 色瓶贮存。 磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。 显色液 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸 17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏 水至1L，棕色瓶避光保存。 酚标准工作液0.05mg/ml
实验操作
试剂/ml 血液 酚标准液 蒸馏水 PH10碳酸盐 缓冲液 底物液 铁氰化钾溶 液 血清 测定管（T） 0.100 ----1.00 标准管（S) --0.100 --1.00 空白管（B） 对照管（C） ----0.100 1.00 ------1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热
临床意义
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高 2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄 疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
生化试验第三组
实验目的

血清碱性磷酸酶活性测定

血清碱性磷酸酶活性测定
共十六页
4.说明计算公式中各值的含义？
5.用标准曲线如何设计本实验操作过程？
共十六页
谢谢
共十六页
内容(nèiróng)总结
血清碱性磷酸酶活性测定。酶催化某一化学反应的能力，其衡量 的标准是。常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。 碱性磷酸酶（ALP）是一组在碱性环境(huánjìng)中水解磷酸酯的酶类。 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在 碱性环境(huánjìng)中有最大活力。碱性磷酸酶在碱性环境(huánjìng)中作用 于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。——。（A标准—A空白） 。在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊 断指标
共十六页
思考题
1. 本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾硼 酸液后必须迅速(xùn sù)混匀？有何影响？
答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH，使其不再 处2.于B最管适与PCH管。在实验中有何作用?不设两管有何影响？
3.实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。意义相同(xiānɡ tónɡ)吗？ 有何区别？
各管吸光度。
*保持反应时温度是均衡的，37°C
共十六页
计算公式:
） （A A — ALP 活力(huólì)= 测定
对照
（ —A A标准
） 空白
X 0.05 X 100（kings单位）
参考值:
成人：3~13 Kings单位(dānwèi)， 儿童：5~28Kings
单位。
共十六页
临床意义
在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指
贫血、恶病质等。
共十六页

血清中碱性磷酸酶活力的测定

血清中碱性磷酸酶活力的测定
1）生理性增加： 生理性增加：
妇女。 妇女。 见于生长中的儿童及妊娠中晚期
2）病理性增加：主要见于（1）肝胆疾病。阻塞性 病理性增加：主要见于（ 肝胆疾病。
黄疸，急、慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活 ALP活 黄疸， 慢性黄疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP 力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。 力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明显。 （2）各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、 各种骨骼疾病如佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、 骨转移癌和骨折修复愈合期等，由于骨损伤或病变使骨细 骨转移癌和骨折修复愈合期等， 胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。 胞内高浓度的ALP释放入血，引起血清ALP升高。 ALP释放入血 ALP升高
问题 酶活力的测定就是测定酶促反应的速 度。本实验的酶促反应速度是如何测 定的？ 影响酶促反应速度的因素很多。本实 验是如何控制各种因素对酶促反应速 度的影响的？ 对于无可见光吸收的被测物，如何使 用可见光光度计进行测定？实验中又 是如何消除各种新增加因素的影响的？
掌握酶活性测定的一般方法 掌握酶活性测定的一般方法
熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法 血清碱性磷酸酶活性的测定
掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义
如何测定酶活性的大小? 如何测定酶活性的大小
酶活性： 酶催化某一化学反应的能力， 酶活性： 酶催化某一化学反应的能力，其 衡量的标准是酶促反应速度的大小。 衡量的标准是酶促反应速度的大小。
适用于自动生化分析仪适用于自动生化分析仪目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法最常用的方法10二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物这种二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物这种方法又可分为

实验碱性磷酸酶比活力测定

实验碱性磷酸酶比活力测定

将测定的数据或计算结果用下表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录。（此为例子）
步骤 总体 积 mL 400 蛋白 mg/ mL 7.24 总蛋 白 mg
酶活 力 U/mL
总活 力 U
比活 力 U/mg
纯 化 倍 数
得 率 %
匀浆过滤液
20.3
正丁醇处理上清液
0.35饱和(NH4)2SO4上 清液 0.7饱和(NH4)2SO4沉淀 溶解透析上清液 DEAE-32酶液 Sephadex G75酶液 Sephadex G200酶液
管号
1
1'
2
2'
3
3'
4
4'
5
5'
加酶时 0.5 m 间 （min）
1m 1.5m 2m
2.5m 3m
3.5m 4m
4.5m 5m
10.5 11 加 NaOH 时间
反应时 间 （min）
11.5
12
12.5
13
13.5 14
14.5
15
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
移液器的使用
• • •
470
440 40.3 9.6 13.2 6.8 3.82 0.49 0.21
33.8
35.3 314.7 1002. 2 451.5 509.3
注意事项
1.
2. 3. 4. 5.
6.
7.
8.
取液量一定要准确。 反应时间一定要精确。 加酶前后一定要将试剂混匀。 空白对照一定要先加NaOH，后加酶。 移液管或微量移液器的使用 比色杯的使用 水浴时试管架可以放进水浴锅中，但要保证水浴锅 的水可以没过试管中样品的位置。 -20oC冻着的样品取出后一定要完全化冻且混匀。

血清中碱性磷酸酶活力的测定

血清中碱性磷酸酶活力的测定

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血清碱性磷酸酶活性测定

血清碱性磷酸酶活性测定

• 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
❤ 实验原理
测定ALP的方法主要分为两种
• 一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力， 如β-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根 的缺点；
• 二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物，这 种方法又可分为：
• 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定。
• 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可 显色，如对硝基苯磷酸二钠（PNPP）法
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。
止酶促反应），否则有影响，偏大。 • 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作
用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。
临床意义
• 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临 床辅助诊断指标。

碱性磷酸酶比活性测定实验报告

碱性磷酸酶比活性测定实验报告

碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。

通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。

二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。

在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。

pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。

通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。

比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。

三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。

长处测定各标准溶液的吸光度。

绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。

配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。

血清碱性磷酸酶活力测定

血清碱性磷酸酶活力测定

1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
铁氰化钾溶液
3.00
3.00
3.00
3.00
血清
——
———
——
0.100
2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各 管吸光度。
计算
ALP活性=（A测定—A对照）/（A标准—A空白） *0.05*100(金氏单位）
临床意义：
血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
实验操作
1.取试管4支，按下表操作
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
底物液
1.00
1.00
注意事项
1. 目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能 久置
2. 底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明 磷酸苯二钠已分解，不宜使用。
3. 加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结 果会有影响。
标准曲线法
制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、 2.9、2.8、2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟， 各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾 2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比 色。将以上各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶 单位(依次为0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸 上作图，绘制成标准曲线。
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问题1:为什么要测定碱性磷酸酶的活性？有什 么意义？
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食高糖、高脂肪 食物等均可使血清ALP活性增高。 2.病理性改变： • 升高
（1）肝胆疾病。主要见于阻塞性黄疸，急、慢性黄疸 性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高， 其中以癌性梗阻最明显。 （2）各种骨骼疾病。ALP主要由成骨细胞产生，故骨骼 病特别是有新生骨质生成时，血液内ALP活性增加，以 促进磷酸盐的沉积。如佝偻病、纤维性骨病、成骨不 全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活 力升高。
诊断常用血清酶
血清酶 符号 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 谷氨酸脱氢酶 GLDH 山梨醇脱氢酶 SDH 丙氨酸氨基转移酶 ALT 异柠檬酸脱氢酶 ICD -谷氨酰转肽酶 -GT 5ˊ-核苷酸酶 5ˊ-NT 单胺氧化酶 MAO 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 肌酸激酶 CK 乳酸脱氢酶 LDH 碱性磷酸酶 ALP 酸性磷酸酶 ACP 淀粉酶 AMS 脂肪酶 LPS 来源 肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 骨骼、牙齿、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺 胰
酶偶联测定法
应用：对于底物或产物不能直接测定或难于准确测 定的酶促反应 。 Ex Ea Ei
A
B
C
P
式中A为底物，B、C为中间产物，P为产物（必须能够直接测定），Ex为待测酶， Ea、Ei都为工具酶。按照工具酶作用的不同， Ea又称为辅助酶，Ei又称为指示酶，C P称为指示反应。
• 问题3：
• 在酶促反应进程中，是否任一阶段的酶促反应速度 都可以代表酶活性？
（一）血浆特异酶
• 在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、 胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。
• •
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚 至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功能试 验的一部分。 血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能 外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液， 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清 碱性磷酸酶明显升高。
什么是ALP?
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通 过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除 去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类 底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去 磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。 • 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
• • • 在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。 1.分泌酶： 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶 （AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶 （LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原 、ALP等。
正常体液中外分泌酶活性低而稳定，不发生催化 作用。
• • •
在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有 关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。 例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。
血清碱性磷酸酶活性测定 （磷酸苯二钠法）
• 问题1：
• 为何要测定血清中酶的活性？有什
么意义？
引言（1）
• 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方 法。酶测定约占目前临床生化总工作量的1/4到 1/2。 • 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十 种。
血浆酶的来源
血浆特异酶 血浆酶 非血浆特异酶 细胞内酶 外分泌酶
引言（2）
• 一些酶在不同器官、组织、细胞内的分布和定 位存在明显差异，而且在细胞内外有明显浓度 梯度差。 • 正常情况下血浆中酶活性相对恒定。但一些病 理情况常导致血浆中酶活性的改变。性别、年 龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人 血浆中某些酶的生理性变化。 • 所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性 和灵敏度。
酶促反应进程曲线
•能够真正代表酶 活性大小的是线 性期的酶促反应 速度，即酶促反 应初速度。
酶促反应初速度
酶活性
酶的含量
• 问题4：
• 测酶活性应注意哪些方面？
酶最适反应条件的选择 • 合适的底物与最适底物浓度 • 底物浓度远远高于酶浓度 • 理想的缓冲液与最适离子强度 • 最适温度 • 最适pH • 合适的辅因子、激活剂浓度 • 合理的测定时间
• 2.代谢酶：（细胞酶） • 在细胞内发挥催化功能的酶。正常时这些 酶存在于组织细胞中，血浆中酶活性很低。细 胞内、外浓度差异悬殊。 • 当酶来源的组织细胞发生病变，细胞膜通 透性增加或细胞坏死时，细胞内酶大量进入血 浆，导致血浆酶活性显著增高。其下降的临床 意义很少。 • 这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢 酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都 可能出现变化。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP or AKP )
• ALP几乎存在于机体各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏 和肾脏中含量较多，儿童期含量尤其多。 • • • ALP有六种同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6来自肝脏， AKP3来自骨细胞，AKP4产生于胎盘及癌细胞，而AKP5来 自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊 断。
• 降低：主要见于呆小症，磷酸酶过少症等。
• 问题2：
• 如何测定酶活性？
酶活性的概念
•
酶活性：酶催化某一化学反应的能力
• 常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量（即酶促反应速度）来表示酶活性大小
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位 时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法）
• 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀 剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产 物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
•连续监测法：
（速率法）
• 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测 定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数 据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 • 适用于自动生化分析仪 • 能动态观测酶促反应进程，结果准确可靠，标本和试剂 用量少，可在较短时间内完成测定。