血清碱性磷酸酶活性测定课件

血清碱性磷酸酶活性测定
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试剂与仪器
器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液 器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
试剂：
•
1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸
钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶
于800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。
底物液
铁氰化钾溶液 血清
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物预热
1.00
1.00
1.00
混匀，37℃水浴保护15min
3.00
3.00
3.00
——
———
——
1.00
3.00 0.100
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水
调零点，读取各管吸光度。
*保持反应时温度是均衡的，3血7清°碱C性磷酸酶活性测定
4.说明计算公式中各值的含义？
5.用标准曲线如何设计本实验操作过程？
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谢谢
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阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨 骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的 ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨 炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复
愈合期等。 •2. 血清ALP活性降低 :
比较少见，主要见于呆小症，重症慢性肾炎、乳 糜泻、 贫血、恶病质等。
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Байду номын сангаас13
思考题
1. 本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化 钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？
答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH， 使2. 其B管不与再C管处在于实验最中适有P何H作。用?不设两管有何影响？
3.实验过程两次水浴保温，一次5min，一次15min。意义相同吗？有何区别？
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计算公式:
ALP 活力=
（A测定—A对照） （A标准—A空白）
X 0.05 X 100（kings单位）
参考值:
成人：3~13 Kings单位， 儿童：5~28Kings 单位。
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临床意义
•在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床 辅助诊断指标。
•1. 血清ALP活性升高 肝胆疾病：
酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈 低。
酶促反应速度=
底物减少量或生成物增加量 单位时间
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实验目的
➢ 掌握酶活力测定的一般方法
➢ 掌握血清中ALP活力测定方 法与临床意义
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思考
•如何测定酶活力的大小？
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是
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注意事项
➢ 酚标准液开后不能久置。 ➢ 底物液不能含有酚，若含酚则显红色，说明磷酸苯二钠已分解，
不宜使用。 ➢ 加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终止酶促反应），
否则有影响，偏大。 ➢ 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避
光保存，如出现蓝绿色即作废。
酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
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酶活力测定方法
•终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底 物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
• 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水 煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分 子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防腐， 在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）
• 3．显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化 钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混 合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝 绿色即弃去)。
• 4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级
标准品。
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实验操作
取4支试管，如下操作：
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
•碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
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•实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠
pH=10
苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化红钾色醌亚胺衍生物
•连续监测法：
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定 酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反 应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。
• 适用于自动生化分析仪 • 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测
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什么是ALP？
•碱性磷酸酶（ALP）是一组在碱性环境中水解磷酸酯的 酶类。
•来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁 等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人 血清中ALP主要来源于肝脏。
•是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸 单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子 和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。
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•————磷酸苯二钠法
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主要内容：
•⑴ 实验目的
•⑵ 实验原理
•⑶ 实验器材与试剂 •⑷ 实验操作 •⑸ 计算 •⑹ 临床意义 •⑺ 注意事项
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基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。