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几种测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)方法

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几种测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC )方法

1.1. 常量肉汤稀释法

1.1.1. 抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于

1000卩g/m如 1280卩g/m或 10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药 物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。 所需抗菌

药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制 100 ml浓度为 1280卩g/m的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为 750卩g/mg用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为 182.6 mg。根据公

式计算所需稀释剂用量为：(182.6 mgx 750卩g/ml) /1280卩g/ml=107.0ml然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀 释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表 5。配制好的

抗菌药物贮存液应贮存于-60C以下环境，保存期不超过6个月。

1.1.2. 药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试 验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊 情况例外。

1.1.3. 培养基 NCCLS 推荐使用 Mueller-Hinton ( MH )肉汤， pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡

萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入 2% (W/V )氯化钠， 按制造厂家的要求配制需要量的 MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用 HTM 肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含 2%~5%溶解马血的MH肉汤。

1.1.4. 接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用 接种环挑取形态相似待检菌落 3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白

(MH )肉汤中，35C孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐 水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2XlO8CFU/ml。 二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈 瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养 18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述 菌悬液进行1 : 100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的 接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养， 以检查接

种物纯度。

1.1.5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管(13 x100mm) 13

支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入 MH 肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液(如1280卩g/m) 0.4ml混匀， 然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比 稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物 的生长对照。此时各管药物浓度依次为 256、128、64、32、16、& 4、2、1、0.5、0.25卩g/ml然后在每管内加入上述制备好的接种物各 1ml,使每管最终菌液浓度约为5X05CFU/ml。第1管至第11管药物 浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 卩 g/ml

1.1.6. 孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35C普通空气孵箱中孵育

16~20h;嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育 20~24h;对可能 的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满 24h。

1.1.7. 结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的 MIC前，应检查生 长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养

情况以确定其是否污染，质控菌株的 MIC值是否处于质控范围。以 肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧 苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断， 与阳性生长对照管比较

抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌 MIC。

根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药(resista nt, R)、敏感

(susceptible, S)或中介(in termediate, I)。S表示被测菌株所引起的感 染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效， 禁忌症除外。R指该菌不

能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制， 或属于具有特定耐药机理(如怜内酰胺酶)，所以临床治疗效果不佳。

I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度， 疗效低于敏感菌。还表示 被测菌株可以通过提高剂量(如怜内酰胺类药物)被抑制，或在药物 生理性浓集的部位(如尿液)被抑制。另外，中介还作为 缓冲域” 以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。

12微量肉汤稀释法

1.2.1. 抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。

1.2.2. MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液 分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔 10 口,1第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20C以下保 存备用。

1.2.3. 接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于 0.5

麦氏比浊标准的菌悬液，经 MH肉汤1 : 1000稀释后，向每孔中加

100 口,1密封后置35C普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试

验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为 20~24h,试验葡萄球菌和

肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满 24h。此

时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、

1、 0.5、0.25、0.125 卩 g/ml

1.2.4. 结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为

MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。 当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高 药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对 革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的 MIC与常量肉汤稀释法

测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。

2. 琼脂稀释法

琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至 50 C左右的

定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌， 孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物 浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌 MIC测定，

结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。

2.1. 培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4o 淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含 5%

（V/V ）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。

2.2. 含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗 菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50C水浴中平衡的MH琼脂中， 充分

混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度 3~4mmo通常按1 : 9比例配制药 物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板 应装入密封塑料袋中，置2~8C冰箱可贮存5天。

23接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬 液，再1 :

10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约 1~2卩）接种 于琼脂平板表面，每点菌数约为 104CFU，形成直径为5~8mm的菌 斑。接种好后置35C孵育16~20h （甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉 素耐药肠球菌孵育时间应满 24h）,观察结果。奈瑟菌属、链球菌属 细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

24结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以 抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂 平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的 最低药物浓度作为终点浓度。

如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板

上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现

象，则应检查培养物纯度或重复试验。

3. E试验（E-test）

E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本 同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩 散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制， 从而形成透明

的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补 了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试 菌的MIC。

3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。

32贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反， 一旦接触琼脂后不得再移动。直径 150mm的平皿内可放置6根E试 验试条，90mm者一般只能放置1根。

3.3. 孵育时间和温度同纸片扩散法。

34结果阅读孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈 和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌 的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。

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最小抑菌浓度定义测试方法

最小抑菌浓度定义测试方法

MIC是指在微生物过夜培养后（一般24小时），抗菌物质能抑制微生物生长的最

低浓度，是对抗菌物质测定的最基本方法。

效价则是指将标准品和被检品放在同一条件下，比较它们的抗菌作用，从而算出被检品的效价单位。

通俗点说：MIC是对抗菌物质有无活性的初检，而效价则是对化合物的活性能力

大小的定量化分析。

最小抑菌浓度

科技名词定义

中文名称：

最小抑菌浓度

英文名称：

minimal inhibitory concentration;MIC

定义：

能够抑制细菌生长、繁殖的最低药物浓度。

应用学科：

水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布

最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵

育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，

用于定量测定体外抗菌活性。 提纯蛋白质后，需要测定其最小抑菌浓度（MIC），有文献提到根据MIC测得的结果计算抑菌率：

抑菌率（%）= (阳性对照OD值—试验OD值) / (阳性对照OD值—阴性对照OD值 )X100

样品的MIC与同性质药物和一些常用药物的MIC进行比较才有意义，不能单纯通过自己样品的结果就

判断出高低，并且不能只用一种细菌。要考虑用不同种类的细菌进行实验，还要做质控。根据抑菌率大

小可以判断是否具有抑菌能力。

可参考以下药敏介绍：

诸多药敏试验方法中，肉汤稀释法是标准方法，琼脂稀释法也可认为属于标准方法。其他任何方法必须与标准方法比较，才能确定可靠性。其他方法之间相互比较没有太大价值。比较须平行测定耐药菌株和

敏感菌株。耐药菌株，被评价方法与标准方法的误差称极重要误差，不得大于3%；敏感菌株，被评价

方法的误差称重要误差，不大于7%。

不同的药敏试验方法，针对不同药物，可靠性不一样。如测MRSA须高盐条件，有的试剂盒中不加盐，

结果不准确，但这不影响肠球菌的测定结果。所以，评价一种方法，应该是有针对性地验证一种细菌对

一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法

一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法

第 1 页 共 3 页 一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法

稀释法是用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低药物浓度的体外办法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最低抑菌浓度（MIC)。CLSI的M07文件系列对于MIC法给出了具体的标准。 （一）肉汤稀释法 肉汤稀释法包括常量稀释法（macrodilution）和微量稀释法（microdilution)。两者原理相同，只是反应液的体积不同。前者采纳试管，每管中菌药混合物体积为2 mL；后者采纳微孔板，每孔菌药混合物的体积为0.1 mL。 1．原理用MH肉汤将抗菌药物对倍稀释，接种一定量的待测菌，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度为MIC；此办法定量测定抗菌药物杀灭受试菌的最低浓度为最低杀菌浓度（minimal bactericidal

concentration,MBC)。 2．培养基MH肉汤为基础培养基，用于常规需氧菌和兼性厌氧菌检测。而相对苛养的细菌，如和流感检测则需要添加养分成分。虽然不是苛养菌，但也需要添加2％（质量浓度）的NaCI以提高耐葡萄球菌的检出率。 3．药物稀释 (1)抗菌药物储存液的配制。抗菌药物干粉不能挺直用于AST，普通保存在-20℃以下的干燥容器中。用法前先配制抗菌药物储存液，其浓度起码为1000 ug/mL（如1280ug/ML）或最高实验浓度的10倍。取少量体积的抗菌药物储存液于无菌玻璃、、或小瓶中，密封置于-60℃或更低温度，需要时解冻并且当天用法，用过的储存液应在24 h后丢弃。大多数的抗菌药物储存液可在-60℃或更低温度保存6个月或以上，其活性无显著变幻。 (2)抗菌药物稀释液的配制。药物稀释液的浓度参考CLSI M100文件表格2的说明折点，试验室可按照实际调节。建议挑选的浓度范围起码包括一种质控菌的折点。对药物储存液举行对倍稀释，其终浓度可为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL（图10-3)。商业化的微孔板则已经在每孔中配制了不同抗菌药物浓度的肉汤，密封包装并置于-20℃（最好-60℃）以下温度保存。一经解冻后不能再 第 2 页 共 3 页 重新冷冻，反复冻融会加速某些抗菌药物，特殊是类药物的降解。 图10-3肉汤稀释法的试验结果（待测菌的MIC为64 ug/mL) 4．细菌接种和培养采纳挺直菌落悬浮法或者肉汤培养生长法举行受试菌菌液的制备，然后用无菌生理盐水或肉汤调节受试菌的菌液浊度为0.5麦氏单位(1.5×108CFU/mL)。在15 min内将校正巧的菌悬液加入肉汤中，使每管或每孔的终于菌含量约为5×105 CFU/mL。对于常量肉汤稀释法可以先将0.5麦氏单位的菌悬液作1:150的稀释，使每管含量约为1×106

最小抑菌浓度

最小抑菌浓度

1.1.常量肉汤稀释法

1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6

mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。

1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。

1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。

1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。

最小抑菌浓度(MIC)及抑菌率的测定

最小抑菌浓度(MIC)及抑菌率的测定

最小抑菌浓度（MIC）及抑菌率的测定

提纯蛋白质后，需要测定其最小抑菌浓度（MIC），有文献提到根据MIC测得的结果计算抑菌率：

抑菌率（%）= (阳性对照OD值—试验OD值) / (阳性对照OD值—阴性对照OD值 )X100

样品的MIC与同性质药物和一些常用药物的MIC进行比较才有意义，不能单纯通过自己样品的结果就判断出高低，并且不能只用一种细菌。要考虑用不同种类的细菌进行实验，还要做质控。根据抑菌率大小可以判断是否具有抑菌能力。

可参考以下药敏介绍：

诸多药敏试验方法中，肉汤稀释法是标准方法，琼脂稀释法也可认为属于标准方法。其他任何方法必须与标准方法比较，才能确定可靠性。其他方法之间相互比较没有太大价值。比较须平行测定耐药菌株和敏感菌株。耐药菌株，被评价方法与标准方法的误差称极重要误差，不得大于3%；敏感菌株，被评价方法的误差称重要误差，不大于7%。

不同的药敏试验方法，针对不同药物，可靠性不一样。如测MRSA须高盐条件，有的试剂盒中不加盐，结果不准确，但这不影响肠球菌的测定结果。所以，评价一种方法，应该是有针对性地验证一种细菌对一种药物测定结果的可靠性。

质量控制及其校准作用

1、纸片法药敏试验

用敏感菌株做质量控制。此外，ATCC25923，ATCC25922，ATCC27853三个菌株还具备校准作用，此点往往被忽视。在NCCLS有关文件中，质量控制一节的第一部分就是讲方法的校准。由于培养基和操作的原因，国内大部分实验室的药敏试验没有经过校准，试验的准确度差异很大。校准过程中，须注意用适合的参考菌株校准相应菌类的药敏试验。如葡萄球菌药敏试验用ATCC25923校准；肠杆菌药敏试验用ATCC25922校准。

2、筛选法药敏试验

必须用耐药菌株做质量控制，最好是低水平耐药菌株。MRS筛选试验以ATCC43300控制。万古霉素筛选试验，以ATCC51299控制。

3、稀释法药敏试验