猴头菌液体培养产多糖条件优化的研究

它用ＩＲ＂　２００８（３）　猴头菌液体培养产多糖条件优化的研究　李宇伟　王新民　王慧杰　连瑞丽　（郑州牧业工程高等专科学校药物工程系，河南郑州４５００１１）　摘要在基础培养基的基础上，研究了不同生长条件对猴头　菌液体培养产多糖产量的影响。结果表明；以２％的蔗糖为碳　源，０．２％的豆饼粉为氮源，０．２％的ＦｅＳＯ￣为培养基可获得较高　多糖。发酵罐放大试验表明，每１０ｏｍＬ发酵液胞外粗多糖含量　最多达１７９．８　ｍｇ，ｐＨ变化比较缓和，表明发酵罐更适合于猴头　菌多糖的产生。　关键词猴头菌液体培养条件优化多糖　文章编号　ｌＯ０ｏ一８３５７（２００８）０３—００１５—０２　猴头菌［Ｈｅｒｌｃｉｕｍ　ｅ　，　ｅ　（Ｂｕｌ１．）ＰｅｒＳ．】，又称猴头菇，属　担子菌亚门（Ｂａｓｌｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ），多孔菌目（Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ），齿菌科　（Ｈｙｄｎａｃｅａｅ），猴头菌属（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ），它是一种珍贵的食用兼　药用菌。其含有能显著提高人体免疫力、抗肿瘤的猴头菌多　糖ｆＩＨ３］，目前主要从子实体中提取；而采用深层发酵液体培养　具有周期短、产量大、适于工厂化等优点，可大幅度提高猴头　菌多糖的生产能力。因此，通过深层发酵能在短时问内大量获　得发酵产物一猴头菌多糖，对开发猴头菌保健品有着重要意　义翻。试验对猴头菌液体培养产多糖条件优化进行了初步优　化，以期为研究开发猴头菌保健品奠定基础。　１材料与方法　１．１供试材料　１．１．１　供试菌株猴头菌—Ｈ　０５（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ　ｅｒ　口ｃｅ　一Ｈ０５），由　郑州牧业工程高等专科学校生物技术实验室提供。接种于　ＰＤＡ培养基上。２５℃培养１０ｄ，４￣Ｃ保藏。　１．１．２培养基①ＰＤＡ培养基：土豆２０％，葡萄糖２％，琼脂　２％，ｐＨ自然（约５．５）。首先将新鲜无病害的马铃薯洗净，去皮　后切成小薄片，称２００　ｇ加５００ｍＬ蒸馏水煮沸３０ｒａｉｎ，过滤，　取滤液，将上述试剂溶解于滤液中，补水至１　０００ｍＬ，分别装　于２５０ｍＬ三角瓶，每瓶１００ｍＬ，０．１０３ＭＰａ灭菌３０ｒａｉｎ。②基　础培养基：葡萄糖２％，酵母粉０．２％，ＫＨ２ＰＯ，０．２％，ＭｇＳ０４・　７Ｈ２０　０．１％。　１．２试验方法　１．２．１摇瓶培养基筛选试验①氮源试验：以１．１．２的基础培　养基为基础，分别以０．２％的蛋白胨、豆饼粉、麸皮、硝酸铵、硫　酸铵、氯化铵、谷氨酸替换其中的酵母粉，试验不同氮源对多　糖产量的影响。②碳源试验：以１．１．２的基础培养基为基础，用　０．２％豆饼粉替换酵母粉，再分别以２％的果糖、蔗糖、乳糖、淀　粉、麦芽糖替换其中的葡萄糖，试验不同碳源对多糖产量的影　响。⑧金属离子试验：以１．１．２的基础培养基为基础，分别以　收稿日期：２００７—１１—１４　基金项目：郑州牧业工程高等专科学校学术学科带头人王新民　资助及河南省杰出青年基金项目（０７４１００５１００１８）的部分研究内容。　通讯作者。　２％的蔗糖及０．２％豆饼粉为碳源及氮源，分别添加０．２％的　ＫＨ￣Ｏ，、ＣａＣ１２、ＭｇＳＯ４－７Ｈ＝Ｏ、Ｆｅ　ＳＯ，、ＺｎＣ１２，试验不同金属离子　对多糖产量的影响。　１２．２培养方法①菌种活化：从保存的母种试管中切出０．５ｃｍ＇－　大小的菌丝块接种于斜面培养基的中部，培养７　ｄ后，再转接　１次，于２５℃培养培养７　ｄ后待用。（　液体培养：首先是种子　液的制备，取１　ａｍ　大小的活化菌种２～３块于基础培养基中　（１００　ｍＬ培养基于２５０　ｍＬ三角瓶），置旋转式摇床、２５℃、　１８０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养７　ｄ；然后进行液体培养，取长满菌球的猴　头菌液体菌种，按５％的接种量接人各组试验培养基中，在　２５℃旋转式摇床，１８０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养７　ｄ。③发酵罐培养：发　酵罐培养基采用最佳产多糖培养基，起始ｐＨ　５．５，压力０．４×　１０５　Ｐａ，温度２５℃，１８０　ｒ／ｍｉｎ，接种紫猴头菌液体种，接种量　１０％（－－级种子液为发酵７　ｄ后的三角瓶液体发酵液），空气　流量为２￣５ＩＪｍｉｎ。　１．２．３分析测定方法①胞外多糖的提取与测定：采用乙醇　沉淀法　，将发酵液３　００Ｏ　ｒ／ｒａｉｎ离心２０ｒａｉｎ分离，用与发酵　液同体积的蒸馏水洗涤，继续离心分离２０ｒａｉｎ。合并上清液，　旋转蒸发后浓缩至发酵液体积的１，２，用３倍浓缩液体积９５％　的乙醇醇析，然后离心２０ｍｉｎ，再用与浓缩液同体积９５％的乙　醇醇析，再离心２０　ｒａｉｎ便得到胞外粗多糖，６Ｏ℃烘干至恒重，　即为胞外粗多糖重量。（　）ｐＨ的浏定：使用经标准缓冲液标定　过的ｏＨ计（上海雷磁ｐＨＳＪ一３Ｃ型）于室温条件下测定ｐＨ。　２结果与分析　２．１　生长条件对猴头菌产多糖产量的影响　２．１．１　不同氮源对猴头茵液体培养产多糖产量的影响由图１　可知，在供试氮源中，猴头菌对有机氮源的利用优于无机氮　源，菌丝体产胞内粗多糖的量及发酵液中胞外粗多糖的量都　明显高于无机氮源；在有机氮源中，以添加Ｏ．２％豆饼粉的培　养基产多糖较多，豆饼粉的利用效果最好。因此选用豆饼粉作　为最适氮源。　麸皮　蛋白胨　豆饼粉　谷氨酸　硫醵馈　硝酸胺　藏化胺　图１　氮源对猴头菌液体培养产多糖的影响　一

１５一　维普资讯 http://www.cqvip.com 食用＇｜ｒ　ＥＤⅡ；ＬＥ　ＦＵＮＧＩ　２００８（３）　２，１，２不同碳源对猴头茵液体培养产多糖产量的影响　以　０．２％豆饼粉为氮源，分别添加其余供试碳源考察不同碳源对　多糖产量的影响，结果见图２。猴头菌对供试的单糖、双糖、多　糖和天然碳源均能较好地利用，其中以蔗糖为碳源的发酵培　养基菌丝体产胞内粗多糖的量及发酵液中胞外粗多糖的量，　明显高于其它碳源，因此选出蔗糖作为多糖发酵的最适碳源。　岫　譬　察　．｝Ｌ　蛙　１　髓　Ｈ－　果糖　蔗糖　乳糖　淀粉　葡萄糖　麦芽糖　图２碳源对猴头菌液体培养产多糖的影响　２，１．３金属离子对猴头茵液体培养产多糖产量的影响　由图３　可知，供试不同金属离子的化合物中，以添加ＦｅＳ０　发酵培养　基所产多糖最多，菌丝体产胞内粗多糖的量及发酵液中胞外　粗多糖的量最多，其次是ＣａＣ１　、ＭｇＳＯ　、ＫＨ２ＰＯ　。因此，在发酵　培养基中加入０．２％的ＦｅＳＯ　有利于猴头菌胞外多糖产量的　提高。　一　Ｍｏ　

蛔ｌ　蛙　ｌ　｛噩　赵　蜒　素　翟　子　链　下降；而ｐＨ变化比较缓和，先下降又缓慢上升，但最终未高出　起始ｐＨ。可看出胞外多糖的产量在８４￣１４Ｊ４ｈ内较高，此时的发　酵液ｐＨ比较稳定，有利于猴头菌菌丝分泌胞外多糖。比较发酵　罐中胞外粗多糖的最大值明显高于前述摇瓶条件下胞外粗多　糖产量，由此可说明发酵罐发酵更适合于猴头菌多糖的生产。　３　小　结　综合上述试验结果，猴头菌产胞外多糖最佳碳源为蔗糖，　最佳氮源为豆饼粉，ＦｅＳＯ　的存在有利于胞外粗多糖积累，也　即筛选出的猴头菌摇瓶最佳产多糖培养基为：蔗糖２％，豆饼　粉０．２％，ＫＨ￣＿ＰＯ４０．２％，ＭｇＳＯ４・７ＨｚＯ　０．１％，ＦｅＳＯ４０．２％。步酵　罐液体培养表明，在整个发酵过程中胞外多糖的产量在８４－　１４４　ｈ内比较大，胞外粗多糖的最大值１７９．８　ｍｇ／１００　ｍＬ发酵　液，此时发酵液ｐＨ值比较平稳，有利于猴头菌菌丝体分泌胞　外多糖。相对摇瓶生长，发酵罐中发酵产生的猴头菌多糖量更　多，说明发酵罐发酵更适合于猴头菌多糖的生产。　参考文献　ｆ　１】　乐超银，邵伟，刘庆刚，等．猴头菌液体发酵条件的研究［Ｊ１．山　西农业大学学报，１９９６，１８（３）：３２－３４．　【２】　刘艳芳，杨焱，贾薇．猴头菌深层发酵培养基筛选初探【Ｊｌ，　食用菌学报，２００３，１０（３）：２６－３１，　【３】　蒋丽，陈惠音，杨汝德．猴头菌深层发酵过程的初步研字…．　食用菌。２００１（２）：９－１１．　［４］　王慧杰，李宇伟，连瑞丽，等．灵芝多糖液体发酵条件优化［ＪＪ＿食　用菌学报，２００７，１４（１）：３７－４１．　［５］　刘祖同，罗信昌．食用蕈菌生物技术及应用［Ｍ］．北京：清华大学　出版社，２００２，１６６－２１２．　食用菌栽培中常见四种错误做法　１　拌料时的常犯错误　把糖、尿素，过磷酸钙，磷酸二氢钾　等肥料直接撒入主料中。这样会造成肥力不均匀，影响产量。　应将其溶解在较大量的水中再拌料。石膏和石灰应拌入粮食　中，混匀后再与主料混合，这样会使培养料ｐＨ变更加均匀。　２堆制发酵时的错误做法建堆时不能用脚踩，否则会形　成厌氧发酵，导致很多弊病，达不到发酵的目的。应自然堆　积，轻轻压实，在堆的中心用竹片或木棒插上数个洞，以便通　气。不要用塑料薄膜覆盖，可用透气的草帘，麻袋或棉壳编织　袋覆盖。如果天气很玲，在起温时可暂时用薄膜。　３在灭菌时常会犯的错误灶内装菌包不能太紧，要有间　隔。不少生产者为了多装，装得紧紧实实一灶，然后，灭菌３０　多个小时，其实这是错误的。宁愿装得少一点，只要灶内达　１００ｏＣ，再稳火１０ｈ，加一灶煤，闷一夜天即可。　４接种时常犯的错误　主要有以下四种：①封口纸不熏蒸，　茵环，像筋不经药水浸泡，反之，接种后３　ｄ左右便出现料口　长霉。（　用甲醛、高锰酸钾或气雾盒熏蒸接种室、箱时，用量　严重不足，认为闻到气味就行。药量不够就达不到致死量，消　毒效果差。这是导致茵包感染率高的主要原因之一，往往会　从接种口的料上长出霉菌。（　使用袋装的菌种时，环口往往　带有杂茵，应用药水清洗茵包表面，然后用经过消毒的刀切　去一截，再放入接种室接种。如果没有按此法处理，很可能几　天后，茵包接种处便有霉菌出现，特别是在天气暖和、雨水多　的霉雨季节极易发生。（　用瓶装种时，要一瓶一瓶的接，接完　一瓶后工具要重新消毒一次。切不可将所有的菌种掏在盒中　来接种，太不严谨，极易失败。　（李正飞）　∞　∞　∞　曲　∞　∞　∞　０　一　＿１Ｅ　８．【．　Ｉ），蛔姐譬絮　翼岳艇滥　维普资讯 http://www.cqvip.com