基于适配体亲和毛细管电泳激光诱导荧光检测重组人促红细胞生成素_
- 格式:doc
- 大小:24.50 KB
- 文档页数:4
第37卷.. 分析化学(FEN=》(IAⅪ厄) 增刊..
2009年.. 10月ChineseJournalofAnalyticalChemistryD076
基于适配体亲和毛细管电泳.激光诱导荧光
检测重组人促红细胞生成素
申睿张朝阳孟庆威谢剑炜郭磊..
(军事医学科学院毒物药物研究所,北京.. 100850)
促红细胞生成素.. (EPO)属于单链酸性糖蛋白,可促进骨髓红细胞的生成、提高机体血红蛋
白的
浓度、改善机体的携氧能力和增强耐力。重组人促红细胞生成素(rHuEPO.滥用重组蛋白除在
短时间
内大量增进运动效能外也具有显著的副作用L1J,建~_rHuEPO.0【的检测方法具有重要意义。
本研究以
荧光标记的具有高亲和力和高特异[~ rHuEPO.谴配体为探针【2J,以本实验室组装的CE-LIF
装置为基
础,建立了一种检测rH让PO.a的分析方法。
毛细管电泳.激光诱导荧光检测系统.. (白行组装)。石英毛细管(内径50,外径365 1,长
49cm,
进样端到检测窗的长度为32e。ruP.lSIROGEopamaetcloay()。三羟
m)HEO0【CPNBi-hrcuiaCmpn深J
JJI
II】
甲基氨基甲烷.. fr
rris)、甘氨酸.. (Amreseo公司),5端标记有荧光基团(FAM)的813,807,39nt由本室
张朝阳筛选得到.. (上海生工生物工程技术有限公司合成),实验用水为超纯水,其它试剂均
为分析纯。
所配制的Trs甘氨酸缓冲液0mlLTi,34mmo/H85经04m孔径
i.G,5 mo/.. rs8lL甘氨酸,p .).5g
滤膜过滤后使用。适配体筛选缓冲液(5mmo/.. rs4mmo/.. C1mmo/.. CI,5 lL
OlLTi,10lLNa,5 lLMg2mmo/..
KCl,pH7.4)。以超纯水溶解并稀释单链DNA至250mol/L,于.. _20。C下避光储存备用。
采用.. 2×TG为分离缓冲液,分离电压为11kV,气动进样(50mbar,5S),20。C下分离并进
行LIF
检测。新毛细管先后以甲醇.. (1n,水.. (0mi)mo/.. OH(0mi)1n)
0mi)1n,l lLNa3n、水(0mi、分离缓
0mm)冲洗活化。每次进样后,毛细管依次用05LNan)3mi、分离缓冲
冲液.. (1.mol/.. OH(2mi、水.. ( n)
液.. f3min)冲洗,以保证分析的重复性。以筛选缓冲液稀释适配体储备液,得到10mol/L
的标准液。
于95。nHEO.混合,用适配体筛选缓冲液定容至2 ,
C下加热5mi,放置室温。将2标准液和ruP0
于4。C下避光孵育。
缓冲液组成在检测适配体与靶分子复合物时起着至关重要的作用。以2×TG为电泳缓冲液,
考察
了样品缓冲液对复合物形成的影响。结果表明,在适配体筛选缓冲液中可观测到复合物峰形
成的趋势,
在2×TG中加入rHuEPO.后,由于蛋白的增敏作用则会使游离适配体的荧光信号增强,未检
测到复合
物峰。电场强度和分离时间可能会影响适配体与靶分子所形成复合物的稳定性,采用高电场
及较短的
分析长度减少复合物的解离及扩散,然而高电场也会产生强的焦耳热使复合物解离。因此针
对不同的
仪器或适配体,选择适当的电场强度。在自组装的CE—LIF上,随着电场强度降低,rHuEPO.的
807适
配体与rHuEPO.0【复合物峰的信号逐渐增强。
比较了具有不同解离常数的适配体F一813(Kd200nmol/L),F.807(Kd100nmol/L),
F.39nt(Kd39
nmol/L)在CE—LIF中与rHuEPO.所形成的复合物稳定性差异。结果表明,随着解离常数的
降低,复合
物的峰面积逐渐增加,复合物的稳定性增强。
在初步优化的实验条件下,F.39nt适配体与.. rHuEPO-a所形成的复合物最稳定。考察了不
同浓度(0,..
10,0,.. 和50mo/)的ruP-与F3n适配.. k40
00mo/所形成复合物的峰面积的变化情
02030
000nlLHEOa-9t~(nlL)
况。结果表明,随着rH】EPO.0【浓度的升高,复合物的峰面积逐渐升高,而游离适配体的
峰面积先增大
然后降低,最初游离适配体的峰面积增大可能是因为蛋白对荧光的增敏作用较强。..
References,
1郭磊,张朝阳,唐吉军,谢剑炜.色谖.. 20
008,26(4):437、4
443
2 ZhangZYGuoL,TangJJ,eta1.
..10.1016/j.talana.20
009.08.028
E—i:uli96malcr
malgoe17@gi.on