毛细管电泳检测DNA的方法建立和其应用

原理
在毛细管中施加电场，带电粒子在电场的作用下产生迁移，由于迁移速度与粒 子所带电荷、半径、质量等因素有关，因此不同粒子在电场中产生不同的迁移 速度，从而实现分离。
发展历程
01
02
03
1980年代初期
毛细管电泳法由 Jorgenson和Lukacs首次 提出并实验验证。
1980年代中期
该技术逐渐成熟，被广泛 应用于生物、医药、环境 等领域。
饮用水安全
毛细管电泳法能够检测饮用水中 的消毒副产物、有机污染物等， 保障饮用水安全。
在食品检测领域的应用
食品添加剂分析
毛细管电泳法能够分离和检测食品中 的添加剂，如色素、防腐剂等，有助 于食品安全监管。
营养成分分析
毛细管电泳法能够快速分析食品中的 营养成分，如氨基酸、维生素等，有 助于食品质量控制和营养评价。
核酸分析
毛细管电泳法能够分离和检测核酸片段，用于基 因诊断、基因表达研究和法医学鉴定。
3
临床检验
毛细管电泳法可用于检测体液中的小分子代谢物， 如氨基酸、糖类等，辅助临床诊断。
在环境监测领域的应用
污染物分析
毛细管电泳法能够分离和检测水 体、土壤中的有害物质，如重金 属、农药残留等，有助于环境监 测和污染治理。
在化学分析领域的应用
有机物分析
毛细管电泳法能够分离和检测有机化合物，如药物、染料等 ，在药物研发、化工生产等领域有广泛应用。
金属离子分析
毛细管电泳法能够高灵敏度地检测金属离子，如铅、汞、镉 等，可用于地质、冶金和环境等领域的研究。
谢谢
THANKS
加样
将处理好的样品加入毛 细管中，注意控制加样
量。
施加电压
启动电源，施加适当的 电压，使带电粒子在电

刑事技术·论 著·2021年 第46卷 第3期基金项目：北京市自然科学基金资助项目（7182022）；河北省法医学重点实验室开放课题（KF201606)第一作者简介：张庆霞，女，河南淮阳人，硕士，主任法医师，研究方向为法医物证检验与研究。

E -mail:********************** 通信作者简介：马万山，男，北京人，学士，主任法医师，研究方向为法医物证检验与研究。

E -mail:136****************网络出版时间：2020-12-29；网络出版地址：https:///10.16467/j.1008-3650.2020.0006DOI ：10.16467/j.1008-3650.2020.0006毛细管电泳联合二代测序技术用于亲子鉴定突变分析张庆霞1，刘金杰1，付丽红1，任 贺2，刘小芳1，陈 冲1，贾 丽1，石 妍1，赵 怡1，焦章平1，刘雅诚1，马万山1,*，李 健2（1. 北京市公安司法鉴定中心，北京100192；2. 北京警察学院，北京102202）摘 要： 目的 联合应用毛细管电泳与二代测序技术，探索肯定亲权案件中的STR 基因座的突变率和突变方式。

方法 2600例肯定亲权关系的案件材料采用PowerPlex21试剂盒进行STR 检验，发现67例存在基因座突变，对该67例亲子关系（62例三联体，5例二联体）的196个样本用SeqTyper ®24构建文库，使用Ion PGM TM 平台进行二代测序。

结果 12个STR 基因座共发现71个突变，父源突变与母源突变的比例为3.13‥1。

其中64例亲子关系观察到1个基因座突变，2例观察到2个基因座突变，1例观察到3个基因座突变，有些突变从毛细管电泳所得STR 基因座结果无法判断是增加还是减少了一步，二代测序则可以明晰等位基因的遗传方式及突变情况。

结论 对于复杂核心序列、含不完全重复单位的基因座，有些突变可以通过二代测序明确突变的来源和方式，更直观地从微观碱基序列的角度观察等位基因的遗传。

毛细管电泳仪核酸分离分析毛细管电泳仪核酸分离分析是一种广泛应用于生物技术和生物医学研究领域的分析方法。

它通过将DNA、RNA或其他核酸样品注入到毛细管中，利用电场的作用使核酸在毛细管内迁移，在电泳分离过程中根据核酸分子的大小、电荷和构象差异，实现对核酸样品的分离和定量分析。

本文将从毛细管电泳仪的原理、实验操作和应用领域三个方面展开介绍。

一、毛细管电泳仪的原理毛细管电泳仪是以电泳为基础的仪器设备，主要由高压电源、注射器、分离柱、检测器和数据处理系统等组成。

核酸样品首先通过注射器被导入到毛细管内，然后通过电场力将核酸分子在毛细管内迁移。

毛细管内的分离柱起到了筛选和分离核酸的作用，不同长度或不同带电性质的核酸分子将被分离开来。

分离完成后，检测器会检测样品，根据检测信号进行数据处理和分析。

二、毛细管电泳仪的实验操作1. 样品制备：将待测核酸样品提取并纯化，测定浓度和纯度。

2. 缓冲液的配制：根据实验需要选择合适的缓冲液，调节缓冲液的pH值和离子强度，以优化分离效果。

3. 毛细管的选择：根据样品特性和分离目标，选择合适的毛细管材料、内径和长度。

4. 样品注入：使用专用注射器将核酸样品注入到毛细管中。

5. 分离条件设置：根据样品的性质和实验需要，设置适当的分离电压、电流和温度等条件。

6. 分析与结果解读：根据检测器所得到的信号，进行数据处理和结果解读。

三、毛细管电泳仪的应用领域毛细管电泳仪核酸分离分析广泛应用于生命科学研究、医药领域以及法医学等领域。

具体应用包括但不限于以下几个方面：1. 生物医学研究：在基因工程、遗传学、分子生物学等领域中，毛细管电泳仪被广泛应用于核酸样品的分离、纯化和测序等方面。

2. 临床诊断：毛细管电泳仪可用于检测和分析人体内的基因突变、染色体异常等，对临床疾病的诊断、预测和治疗具有重要意义。

3. 食品安全监测：毛细管电泳仪可以对食品中的转基因成分、有害物质和添加剂等进行快速准确的分析，为食品安全监测提供科学依据。

说明毛细管电泳特点及应用
毛细管电泳是一种高效液相色谱技术，其基本原理是利用电场将带电粒子在毛细管中的移动速率和荷电量的差异进行分离和富集。

毛细管电泳具有高分离效率、快速分离、小量样品、自动化程度高等特点，已经成为了化学、生物、环境学等领域的一个重要分析工具。

其主要应用领域和特点如下：
1.分离生化分子
毛细管电泳可以用于分离和富集DNA、RNA、蛋白质、糖类和小分子有机物等生物分子。

这些生物分子在酸碱性、水解、氧化还原等条件下有不同的化学性质和电荷性质，可以被毛细管电泳技术精确分离和定量。

例如在DNA分离和定量方面，毛细管电泳已经成为PCR扩增产物检测、基因测序、DNA指纹鉴定等分子生物学技术中的重要手段。

2.分析环境污染物
毛细管电泳可以用于环境监测和食品安全检测等领域，可以对水、空气、土壤和食品中的有机和无机污染物进行快速准确定量分析。

例如利用毛细管电泳技术可以分析环境中的氨、硝酸盐、荧光增白剂、PESTICIDE 等有害物质含量，以及酒类中的苯甲酸、乙酸等有害物质。

3.分析药品和代谢产物
毛细管电泳可以快速、灵敏地分离和鉴定药品和代谢产物，具有药动学和毒理学研究的重要意义。

毛细管电泳技术节省反应时间，减少实验操作时间，可对液-液、液-固、固-液等反应进行分离和分析，得到精确的数据和结果。

如利用毛细管电泳技术，可以分析身体内的有机酸、氨基酸、代谢产物等物质。

总之，毛细管电泳技术在化学分析和生物分析中均有广泛应用，且已成为学术研究和工业生产的一种重要分离分析手段。

毛细管电泳测序原理毛细管电泳测序是一种基于DNA片段长度差异的测序技术，其原理是利用毛细管电泳分离DNA片段，并根据片段移动速度的差异确定序列信息。

首先，需要通过PCR扩增得到目标DNA片段。

PCR是一种体外DNA扩增技术，通过DNA聚合酶的作用，将目标DNA序列扩增至足够数量，以便进行下一步的测序分析。

接下来，将PCR产物加入到含有聚合物的毛细管内，并施加电场。

在电场的作用下，DNA片段会被吸附在毛细管内壁上，并形成一个移动带。

然后，施加电场，并在毛细管两端连接电源，使得电场通过毛细管内的DNA移动带。

不同长度的DNA片段根据其分子量不同，会以不同的速度移动，分离出DNA片段。

在这个过程中，由于DNA片段的质荷比不同，所以在电泳过程中会出现DNA 片段的离子机流效应。

DNA片段的离子机流速度与其质量成反比，因此，越长的DNA片段离子机流速度越慢。

当DNA片段离子机流速度相等时，移动速度以及移动距离的大小就取决于DNA 片段的长度。

因此，通过观察移动带的长度，可以确定DNA片段的长度信息。

为了准确测序，通常还需要将目标DNA分成四份，并分别加入四种带有荧光标记的特异性引物。

这些引物会与目标DNA片段互补配对，并在DNA扩增过程中，序列确定位置为反应产物的末端，引物上的荧光标记用于定位。

接下来，将四种标记的引物混合加入PCR反应混合液中，并进行PCR扩增。

在扩增过程中，引物会进行无模板扩增，因此会得到四种不同长度的扩增产物。

随后，将PCR产物经过毛细管电泳分离，根据DNA片段长度的差异，可以将这些扩增产物分离开来，并观察每一带的荧光信号的顺序。

通过分析荧光信号的顺序，可以得到DNA序列的信息。

由于每一个碱基都分别用不同的荧光色标标记，因此可以通过观察荧光信号的顺序获取DNA序列。

毛细管电泳测序的优点是测序速度快、准确度高，可以同时进行多个样品的测序。

毛细管电泳测序仪器相对简单，操作方便，适用于中小型实验室。

蛋白质分离
毛细管电泳技术能够高效分离蛋白质 ，包括白蛋白、球蛋白、酶等，为生 物制药、蛋白质组学等领域提供有力 支持。
DNA和RNA分析
毛细管电泳可用于分析DNA和RNA片 段，在基因诊断、基因工程和生物信 息学等领域有广泛应用。
药物分析
药物成分分离
毛细管电泳能够分离和检测药物中的有效成分和杂质，有助于药物质量控制和研发。
仪器设备与操作
仪器设备
包括高压电源、进样系统、毛细管、检测器和数据采集系统等部分。
操作步骤
首先将样品注入毛细管一端，然后施加电压使带电粒子在电场中移动，同时通 过检测器对分离出的粒子进行检测，最后通过数据采集系统记录数据并进行分 析。
02
毛细管电泳的分离模式
区带电泳
总结词
区带电泳是毛细管电泳中最简单的一种形式，其原理是将样 品加在毛细管的一端，然后施加电压，使样品在电场的作用 下进行分离。
详细描述
在区带电泳中，样品在毛细管中形成一色带，由于不同组分 在电场中的迁移率不同，因此会以不同的速度向另一端移动 ，从而实现分离。这种分离模式适用于简单样品，如氨基酸 、肽和蛋白质等。
胶束电动色谱
总结词
胶束电动色谱是在毛细管电泳中加入一种称为表面活性剂的物质，使溶液的离子 强度和粘度发生变化，从而影响离子的迁移率。
要点二
血液中成分分析
通过毛细管电泳技术，可以分析血液中的离子、小分子和 蛋白质等成分，为临床诊断和治疗提供依据。
04
毛细管电泳技术的优缺点
优点
高分离效率
毛细管电泳技术利用电场对带电粒子的作用力，使其在毛 细管中分离，具有极高的分离效率，特别适合于复杂样品 的分离。
高灵敏度
毛细管电泳技术结合了多种检测手段，如紫外-可见光谱 、荧光光谱等，可以实现高灵敏度的检测，有利于痕量物 质的检测。

毛细管电泳法简介毛细管电泳法是一种常用于分离和检测化学物质的分析技术。

它基于样品在电场作用下在毛细管中的迁移速度的差异，利用电泳现象进行分离。

该方法具有分离效果好、分析速度快、样品消耗少等优点，被广泛应用于生物、环境、食品等领域的分析研究。

原理毛细管电泳法的基本原理是利用电场作用下带电粒子在毛细管中的迁移速度差异分离物质。

当样品通过直径较小的毛细管时，由于电场的作用，带电物质会在毛细管中产生电泳迁移。

迁移速度快的物质会较早到达检测器位置，而迁移速度慢的物质则会滞留在毛细管中，从而实现了物质的分离。

毛细管电泳法主要利用了物质在电场、毛细管中的迁移速度与其电荷、粒径、溶剂性质等因素之间的关系。

其中，电荷是最重要的因素之一。

毛细管电泳法可分为两种类型：正交电泳和非正交电泳。

正交电泳主要用于带电物质的分离，而非正交电泳则用于非带电物质的分离。

操作步骤1. 准备工作在进行毛细管电泳实验之前，需要准备好以下实验器材和试剂：•毛细管电泳仪•毛细管•电解质缓冲液•样品溶液2. 设置电泳条件根据实验需要，设置好合适的电场强度、电解液pH值和缓冲液浓度等参数。

这些参数的选择对于实验结果的准确性和分离效果的好坏至关重要。

3. 毛细管填充将毛细管浸入缓冲液中，通过电力作用使缓冲液进入毛细管，直至毛细管完全填充。

4. 样品进样通过微量注射器将样品溶液缓慢注入毛细管，注意避免气泡的产生。

5. 开始电泳将毛细管两端插入正、负电极中，开启电源，开始电泳过程。

6. 结果分析根据实验需要，可以选择不同的检测方法进行结果分析，如紫外检测、荧光检测等。

应用领域毛细管电泳法广泛应用于生物、环境、食品等领域的分析研究。

具体的应用包括：1.蛋白质分析：毛细管电泳法可用于蛋白质的分离和定量分析，对于药物研发、生物学研究等具有重要意义。

2.DNA分析：毛细管电泳法可以用于DNA序列分析、基因突变检测、DNA测序等领域，对于遗传学研究、法医学等具有重要意义。

2011-12-31 毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用分析化学毛细管电泳技术及其在检测分析中的应用摘要：毛细管电泳技术(CE)作为现今一种主要的分析技术，凭借其高效、灵敏、快速、设备简单、广泛适用性等特点，广泛应用于各个领域。

本文简要概述了CE技术的原理及特点，并简述了它在环境分析、食品分析、药物分析、生物大分子分析等各个领域的应用。

关键词：毛细管电泳；分析；应用1.毛细管电泳技术简介1.1 产生与发展毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）是一种在电泳技术的基础上发展的一种现代分离技术。

电泳技术作为一种分离技术已有近百年历史，1937 年A.Tiselius首先提出：传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热。

1967年，Hjerten最先提出了毛细管电泳的雏形，即在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳。

但他并没有完全克服传统电泳的弊端。

直至1981年Jorgenson和Lukacs提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 这时现代毛细管电泳技术真正产生。

1984 年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。

1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。

同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。

近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。

毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。

（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。

（3）操作模式多，开发分析方法容易。

（4）实验成本低，消耗少。

（5）应用范围极广。

自1988年出现了第一批毛细管电泳商品仪器，短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。

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毛细管电泳实验：分离DNA片段毛细管电泳是一种基于电场作用下溶液内带电粒子迁移的分离技术。

在生物学领域中，毛细管电泳广泛应用于分离和分析DNA、RNA和蛋白质等生物大分子。

下面是利用毛细管电泳进行DNA片段分离的实验步骤：1.DNA片段制备：将需要分离的DNA样品按一定比例混合加入一定量的缓冲液，再加入一定浓度的酶切剂，在恒温下酶切一段时间，得到所需长度的DNA片段。

2.毛细管电泳仪预备：将毛细管电泳仪加入合适的缓冲液，调节电泳仪温度，预热至所需的电泳电场。

同时在电泳仪中放置一定量的聚丙烯酰胺凝胶。

3.样品注入：在毛细管电泳仪的样品孔中加入所需的DNA片段样品。

4.电泳运行：将电泳仪的电场开启，样品在电场作用下逐渐分离。

DNA片段按照长度和电荷进行分离，较短的片段在电泳仪中运行得更快，较长的片段则运行得更慢。

5.结果分析：根据电泳仪中的标尺和样品在凝胶上的分布，判断所得到的DNA片段的长度和含量等信息。

需要注意的是，DNA片段的制备和实验操作需要遵守一定的生物安全规范和操作流程。

同时，在进行毛细管电泳实验中需要准确控制电泳电场、电泳时间和缓冲液组成等参数，以保证实验结果的可靠性。

通过合理的实验设计和数据分析，可以得到所需的DNA片段的分离和分析结果，为后续的研究提供重要的参考数据。

再写一个磁共振成像实验：脑部结构成像磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）是一种通过使用强磁场和无线电波来生成人体内部图像的无创性医学影像技术。

MRI可以用于对人体内部的各种组织、器官以及生物分子等进行成像和检测。

其中，MRI脑部结构成像可以用于观察脑部各种组织结构的形态和位置，为临床医学提供重要的诊断信息。

以下是MRI脑部结构成像的实验步骤：1.患者准备：患者需要脱掉身上的金属物品，如手表、钥匙、银饰、眼镜等，以避免金属物品对磁场的干扰。

2.患者安置：患者被安置在一个圆筒形的磁共振仪中，并保持安静不动。

毛细管电泳原理及其应用学院：海洋港口学院班级：14制药工程学号：1423014113 姓名：蒋佳丽时间：2015年1月7日前言毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是近十几年来迅速发展起来的一种分离技术，虽说在上世纪六七十年代就有人对毛细管内电渗流形式做了理论探索并也开始尝试毛细管电泳技术，但都因为受到检测器灵敏度限制、电泳过程中产生的焦耳热无法有效散失等因素的制约，影响分离效果。

八十年代初，外壁涂有聚二酞亚胺，内径小于100}m 的熔融石英毛细管的使用[1]及检测器灵敏度的提高大大推动了毛细管电泳技术的发展，由于CE具有普通电泳和色谱的优点及具有高效、高灵敏度、快速、低运行成本、犬信息量和易于自动化等特点，近年来在生物化学、临床诊断、法医刑侦学等领域应用广泛。

一、CE设备及原理毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间的淌度及分配上的行为差异而实现分离目的的一类液相分离技术。

其仪器装置一般由以下几部分组成(见图一)1.高压电源;2.毛细管;3.在线检测器;4.电极及电极液;5.加样系统。

毛细管是由熔融石英加工制成的(内径20一100}m，长度为20一100cm )，外壁涂有一层聚二酞亚胺以增加其柔韧性，内壁通常直接和溶液接触，有时也可根据需要涂上一层高聚物。

与平板凝胶电泳类似的，毛细管内也可填充支持介质，如琼脂糖，聚丙烯酞胺及甲基纤维素等。

图一毛细管电泳仪装置示意图(Tagliaro, 1998)[1]在线检测器位于距样品盘约三分之二至五分之四毛细管总长处，对毛细管壁内部进行光学聚焦(在此处的毛细管外壁的保护层是被烧掉或刮去的，以利于光的通透)。

在线检测器通常有紫外、荧光和激光等多种检测方式。

对DNA的分析通常使用紫外检测，对200bp的DNA片段的最小检测浓度是O.5mg/L。

但对于生物样品中在和许多其他成分共存的痕量物质测定时，或对特殊分析(如DNA序列测定)时就要使用激光诱导的荧光检测器(laser induced fluorescence, LIF)，使用LIF在非液相毛细管电泳中的检测灵敏度要比非激光诱导的荧光检测提高6倍[2]，比紫外检测高100倍。

毛细管电泳的基本原理及应用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。

该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。

可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。

关键词：毛细管电泳原理分离模式应用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。

CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。

但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。

现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。

1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。

1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。

同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。

近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。

毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。

C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。

毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。

、ห้องสมุดไป่ตู้
作者单 位：①５ ０ ８ １０ ９中山大学 中山医学 院化学教研室 ②５ ０ ７ １２ ５中山大学 化学与化工学 院
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２０ ０ ２年第 ｌ ４卷第 ３期
ｌ ９
许 多聚合物已成功用于 Ｄ Ａ测序。 Ｎ 如线性 聚 丙烯 酰胺 （Ｐ 、聚 环 氧乙烯 （ Ｅ Ｌ Ａ） Ｐ Ｏ）、羟 乙 基 纤维 素 （ Ｃ） 聚 二 甲基丙烯 酰 胺 （ ＤＭＡ） ＨＥ 、 Ｐ 、 聚乙烯吡咯烷酮 （Ｖ ）、 Ｐ Ｐ 尾部具有碳氟化合物 的聚 亚 乙基 二 醇 、半乳 甘露 聚糖 、聚 丙烯 酰 氨 丙 醇 及一 些 共 聚物 等 。据 观 察 ，聚合 物 的分 子 量越 大 ，最 大 可测 碱 基数 越 大 ，但 对 短 片段 的 分离也越差 。线性高聚物 比分支高聚物更适于 分离 长 ＤＮＡ 序列 片段 。 目前 ，不 论从 最 大 可测 碱 基 数还 是 从 分 析 速度来看 ，线性聚丙烯酰胺都是最好 的筛分介 质 。以 ０５ （ ．％ ｗ ）相对 分子 质量 ２— ０ ７ １４及 ２ （ Ｗ ）相 对 分子 质量 １Ｍ 或 １Ｍ 的线 性 ％ Ｗ／ ０ ７ 聚丙烯酰胺混合物为筛分介质 ，并将电场强度 、 柱 温优 化 ，２ ｈ内最 大可 测碱基 数 为 １ ０ 对 ， ０ ３
１ ８
现代 医学 仪器与应用
毛 细管 电泳在 Ｄ Ａ测序 中的应 用 Ｎ
周 琼。 陈缵 光。 莫金 垣 。 夏 笔 军
摘 要 毛 细管 电泳 （ Ｅ）是 ＤＮ 测序的一项有 力工具 。本 文讨论 了样 品前处理 、进样 、筛 分介 ｃ Ａ
质 、电场 强度 、温度 、以及 ＤＮ Ａ标 记对 于 ＤＮ 测序的影响 ：将多毛细 管列阵与单根 毛细管系统作 了 Ａ 比较 ， 并介绍 了在线进 行整个 Ｄ ＮＡ测序操作 的 自动化 系统 。 关键 词 毛细管 电泳 ：ＤＮＡ测序

色谱分析法和毛细管电泳分析法的基本原理与应用在现代化学中，分析技术是不可或缺的一部分。

众所周知，分析技术有很多种类，例如，质谱分析、放射性分析、光谱分析等等。

然而，本篇文章将重点讨论色谱分析法和毛细管电泳分析法这两种分析技术的基本原理与应用。

一、色谱分析法的基本原理与应用色谱分析法是一种从杂质混合物中分离纯化化学物质的技术。

它基于不同组分在特定条件下通过固定相和移动相之间的相互作用，实现组分的分离和定量化分析。

在色谱分析法中，样品溶液被喷洒到固定相上，然后通过移动相流动，不同化学物质因其物理化学性质差异，从而可能在固定相上停留不同的时间，从而被分离。

色谱分析法又分为气相色谱和液相色谱两个主流技术。

1. 气相色谱气相色谱是一种以气体作为载体的色谱技术。

它基于杂质在蒸汽状态下通过固定相时与它相互作用的特定适配关系，实现杂质的分离和定量化分析。

分离组分是根据它们的挥发性、极性、分子量、化学反应性等从样品中引导到固定相上的微小涂层上，通过气流来驱动气溶胶在涂层上的流动。

2. 液相色谱液相色谱是一种以液体作为载体的色谱技术。

它基于样品在液相中分离和移动的特性，通过以固定相对其它组分有不同的吸附性能，完成对有机化合物、药物等成分的分离和提纯。

具体而言，液相色谱的分离过程通过在移动相中加入一种固定相，通过样品流动的压力差在二者中达成交换，样品分子成分被吸附在不同程度的高校固定相上。

那么，色谱分析法有哪些具体应用呢？1. 生物医学分析色谱分析法广泛应用于生物医学分析，并成功用于药物的分析，纯化和鉴定。

比如进口药物中已知的有毒成分，利用气相色谱可以进行快速检测，而液相色谱则可用于肝炎病毒和细胞生化结构的分析。

2. 环境分析色谱技术在环境分析中也有着不可替代的作用。

如有机物质、金属离子、化学反应物等的分离和测定。

其中，危险废物的色谱分离技术得到广泛的应用。

3. 食品质量检测色谱技术在食品质量检测中也有所应用。

它可以用来进行食品添加剂和有害物质的检测。

基于三引物荧光PCR-毛细管电泳法的FMR1基因突变检测技术建立及其在自闭症辅助诊断中的应用孙莉;杨琳艳;叶倩平;杨旭;杨学习【摘要】目的对自闭症患者FMR1基因5'非编码区CGG重复序列及重复数进行检测,探索检测脆性X综合征的新方法. 方法应用三引物荧光PCR-毛细管电泳法(Qseq100TM全自动核酸分析系统检测)对111例自闭症患者进行筛查,检测其FMR1基因5'非编码区CGG序列,计算CGG重复数,并与ABI 3500Dx基因分析仪毛细管电泳测序法进行结果比较验证. 结果 111例临床检测为自闭症的样本中,有2例为FMR1前突变携带者,一例为中间型.与3500Dx毛细管电泳测序结果一致. 结论三引物荧光PCR-毛细管电泳法能够用来检测FMR1基因5'非编码区CGG重复序列,在脆性X综合征发病机制及大规模携带者筛查方面都具有一定的应用价值.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2017(009)005【总页数】6页(P319-324)【关键词】自闭症;FMR1基因;脆性X综合征;三引物荧光PCR-毛细管电泳【作者】孙莉;杨琳艳;叶倩平;杨旭;杨学习【作者单位】华北石油管理局总医院检验科,河北,任丘062552;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;广州市达瑞生物技术股份有限公司,广东,广州510665;南方医科大学基础医学院,广东,深圳518110;南方医科大学检验与生物技术学院,广东,广州510515【正文语种】中文脆性X综合征是X连锁不完全显性遗传病［1⁃2］，是最常见的遗传性智力障碍类型之一。

其致病基因为FMR1（fragile X mental retardation 1），位于X染色体上的Xq27.3［3］，该病主要是由于FMR1基因5′非编码区的CGG重复序列动态突变导致。

根据CGG重复数不同可以分为4种类型：全突变（＞200个CGG重复），前突变（55～200个CGG重复），中间型突变（45～54个CGG重复）和正常型（＜45个CGG重复）［4］。

（１ 普 通 荧 光 检 测 器 ：采 用 氚 灯 （低 波 长 ＵＶ 区）、氙弧灯 （ＵＶ 到可见光 区）和钨灯 （可 见光区 ）作 为激发光源 ，即为普通荧光检测器 。对 荧光 黄检测限 可达 ２ｎｇ／ｍＬ，这个结 果和 用氚 灯测 定 ２４０ｎｍ 下的 吸光度相 比 ，只是后者的 １［］。
（２）激 光诱导荧 光检测器 （ＬＩＦ ：激光 的高 光流 量 、聚光性 、单 色性等 特点使 其成 为理想 的激励源 。 常 用 氦－镉 激 光 器 （３２５ｎｍ ）和 氩 离 子 激 光 器 （４８８ｎｍ 。对荧光 黄最 低检 测限 为 １０－ ｍｏｌ／Ｌ，约 ６００００个分子或更低［。 有关ＬＩＦ的应用可参见最 新文献［１。
５ 电化学检测器
电化学检测器 （ＥＣ）可避免 ＣＥ中光学类检测器 遇到的光程太短 的问题 ＥＣ和 ＬＩＦ同为 ＣＥ中灵敏 度最高的检测器 ，其缺点在于商 品化较难 ，至今没有 商品 电化学检测器供 应 。
（１电导检测器 ：柱 上电导检测是 在毛细管 壁上 用激 光钻 两 个孔 ，插 上 两根 铂 电极 ，再 将孔 封 住 即 成。其检测限 以 Ｌｉ＋计可达 １０－７ｍｏｌ／Ｌ １０－１８ ｍｏｌ［２０］。柱尾检测 则在 分离毛细管后再接上 电导检 测器 。还有 的是将柱尾 电导检测器和 安培检测器组
×１０－ｍｏｌ１．３ １０－１２ｍｏｌ／Ｌ １３］。还出现荧光二极 管 阵 列检 测 器［４和 ＬＩＦ／电荷 藕 合 器 件 （ＣＣＤ）系 统［１］，对 ＦＩＴＣ衍生氨基酸 的检 测限为 ２ １０－２０ｍｏｌ （约 １０－１２ｍｏｌ／Ｌ。最新的动向是采用价格低廉的半 导体激光器作激励源［１６］，激发波长在 ６３５ ８５０ｎｍ， 用于可 见和近红 外区 ，检测 限可达 ｆｍｏｌ级。
用激 光束 聚焦到毛 细管 上 ，产生 的散射光 由一 束 围绕着毛 细管 的光纤 引导到拉曼光谱仪 的接收器 上 ，即构成 了激光 拉曼检测器 ，检测限 以甲基红计 ， 为２．５ １０－６ｍｏｌ／Ｌ［２６］，与ＵＶ检测器相当。也可采 用 ＣＣＤ作拉 曼光谱检测器 ［２７］。这种检测方法 的最 大特点是能 获得 溶质 的结构信息 。

毛细管电泳的基来源根基理及利用之杨若古兰创作摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的电泳分离分析方法.该技术可分析的成分小至无机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等.可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC分析高效、快速、微量.关键词：毛细管电泳道理分离模式利用1概述毛细管电泳 (Caillary Electrophoresis)简称 CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术.CE 的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最早提出在直径为3mm 的毛细管中做自在溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE).但他没有完整克服传统电泳的弊病[1].此刻所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离.1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的次要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC).1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行.同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作.近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的利用范围.毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，是以在很大程度上HPCE与HPLC可以互为弥补，但是不管从效力、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了必定的上风毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具无效力更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、利用面同样广泛等长处外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单.C E只需高压直流电源、进样安装、毛细管和检测器.毛细管电泳具有分析速度快、分离效力高、试验成本低、耗费少、操纵简便等特点，是以广泛利用于分子生物学、医学、药学、材料学和与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2].2毛细管电泳的设备和基来源根基理毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的电泳分离分析方法[3].毛细管电泳仪的基本构成如图1、1 所示 .熔融石英毛细管的两端分别浸在含有电解缓冲液的贮液瓶中，毛细管内也充满同样的电解缓冲液.在毛细管接收端之前安装在线检测零碎.被分析样品可以从进样零碎采取重力法、电迁移法、抽真空法等多种进样方式引入到毛细管的进样端.当样品被引入后,便开始在毛细管两端施加电压 .样品溶液中溶质的带电组分在电场的感化下根据各自的荷质比向检测零碎方向定向迁移.CE中的毛细管目前大多是石英材料.当石英毛细管中充入pH值大于 3的电解质溶液时 ,管壁的硅羟基(- SiOH)便部分解离成硅羟基负离子(- SiO-) ,使管壁带负电荷.在静电引力下 ,- SiO-会把电解质溶液中的阳离子吸引到管壁附近，并在必定距离内构成阳离子绝对过剩的扩散双电层 (见图 2[4]).在外电场感化下 ,上述阳离子会向阴极挪动.因为这些阳离籽实际上是溶剂化的(水化的)，它们将带着毛细管中的液体一路向阴极挪动，这就是 CE中的电渗流(EOF).电渗流的强度很高，乃至于所有进入毛细管中的样品，不管是阴离子、阳离子或中性分子，都会随着液体向阴极挪动.因待测样品中正离子的电泳方向与电渗流方向分歧，故最早到达毛细管的阴极端;中性粒子的电泳速度为零 ,迁移速度与电渗流速度相当；而负离子的电泳方向则与电渗流方向相反，但因电渗流速度约等于普通离子电泳速度的 5～7倍[5]，故负离子也将在中性粒子以后到达毛细管的阴极端.因为各种粒子在毛细管内的迁移速度纷歧致，因此使各种粒子在毛细管内能够达到很好的分离.3 毛细管电泳的分离模式根据分离道理分歧，CE分离基本模式有6种，如表 1 所示.表 1 毛细管电泳的分离模式和利用Tab. 1 Separation modes and application of CE以上各模式以毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动毛细管色谱这3种利用较多.4 毛细管电泳的利用4.1 CE在药物成分分析中的利用目前，CE在天然中草药分析领域中的利用次要集中在生物碱和黄酮及其甙类方面、蒽醌类分析也有报导.生物碱有类似于碱的性质，在pH < 7的缓冲液中利用 CZE 分离.纪秀红等[6]拔取马钱子碱为内标物，在磷酸/甲醇缓冲溶液中 ,测定了小檗碱、巴马亭、药根碱的含量.黄酮类化合物大多是中性分子，次要采取 MECC 模式分离.LiYM[7]以SDS(十六烷基磺酸钠)为阴离子概况活性剂将黄芩中的 6 种次要的黄酮类化合物分离.李伟等[8]以磷酸盐为缓冲体系 ,利用 CZE模式分离、测定了大黄提取液中离蒽醌化合物的含量.4. 2 CE在手性拆分中的利用CE因其高效、快速、选择性强的特点而成为目前最无效的手性拆分方法.各种CE分离模式皆可用于对映异构体分离，是以手性拆分成为 CE利用最活跃、最独特的领域.其中，添加剂法只需向电泳缓冲液中加入合适的手性试剂，经过必定的分离条件优化即能实现手性分离.又因为可选择的添加剂品种很多，此法是 CE进行手性拆分的次要方式.目前 ,次要的手性添加剂有环糊精类（CDs)、冠醚类、大环抗生素、蛋白质等.仅环糊精一类就有α-CD，β-CD，γ-CD，HP-α-CD， CM-β-CD 等多种添加物资 ,其利用十分广泛.此外，其他品种添加剂的利用结合MECC和 NACE 模式基本上能实现各种手性药物的拆分[9～11]. 4.3 CE用于肽和蛋白分析CE在蛋白质分离分析中的利用次要包含肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、定性和动力学研讨.CE在肽和蛋白质的别分析中利用最多的是CZE测定肽谱， SDS-CGE测蛋白分子量及CE-MS 直接测定分子量.用CZE还可测定蛋白的物理参数，如蛋白的无效尺寸、电荷和扩散系数.用CIEF测定蛋白等电点比平板凝胶电泳测等电点的方法简单，可直接监测.蛋白被酶解或化学裂解成肽片断，利用CZE的高分辨率分离后所得的电泳图称CE肽图.肽图是进行蛋白序列分析的第一步，随后可用CE进行微量制备，再测定各片断的氨基酸序列，即可得出全部蛋白的一级结构.CE的制备总量比高效液相色谱低，只适用于微量制备.对扩散系数小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，是以CE被用来作为收集非常纯的单一馏份的微量制备的手段.在有些情况下，CE定量线性范围可达(3个数量级).4.4 CE用于糖类的分析近年来，毛细管电泳已成为分析单糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等糖类化合物的无力兵器，在糖型分析.方面也取得了较大的成功单糖的pKa6值普通大于11，故需选用强碱性的缓冲液（pH>11），使糖基上的羟基去质子而带负电荷，直接进行电泳分离，用紫外（195nm）检测.也能够选用硼酸盐缓冲液，硼酸盐与糖基络合构成带负电荷的络合物以进行电泳分离，用紫外检测.简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析[12].多糖普通利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析.糖蛋白经蛋白酶酶解后生成糖肽，糖肽的图谱被认为是糖蛋白的指纹图谱.糖肽的分离主如果基于其pKa值的分歧而进行CE分离，其实不是基于糖链结构的分歧，是以所选用的缓冲液的构成及其pH的选择尤其次要，其检测也是基于蛋白质的检测.糖脂既可以直接用CE分离，也能够用神经酰胺聚糖酶将糖链释放出来后进行分析.糖胺聚糖（GAG）类糖基的聚糖部分有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和肝素等，普通都含有反复的二糖单元，而且可用裂解酶降解成糖醛酸化酸性寡糖，这些寡糖既带电荷又有紫外接收（232nm），是以很适合用CE进行分析.另外，CE在糖型分析方面也取得了较大的成功.在糖的检测方面，紫外分析是最早用于CE进行糖类检测的，但它的灵敏度绝对不高，检出限普通只要10—6mol数量级.利用激光引诱荧光检测对糖类进行柱前高效荧光标识表记标帜，可使检出限达到10-9mol水平.在改进检测零碎的同时，中性糖类的极性标识表记标帜也在不竭改进与完美.其中一种极性标识表记标帜物为8-氨基-萘-1，3，6-三磺酸，利用其可以快速高效地对均一寡糖和复杂多糖进行分离分析，具有很高的分辨率.4.5 CE在临床化学上的利用CE 在临床化学中的利用十分广泛, 所检测样品的来源可分为尿样、血浆血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织和实验动物活体(invivo)试验.被分析的组分则包含肽类、各种蛋白、病毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子、药物及其代谢产品.具体利用可分为: 临床疾病诊断临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研讨、病理研讨、同工酶分析、聚合酶链反应(PCR )产品分析、DNA 片断及序列分析等.所利用的CE 模式包含CZE、MECC、CGE、 CITP 和毛细管等电聚焦(CIEF)[13.14].4.6 CE用于检测非均一性(多样性, Heterogeneity)很多纯化蛋白, 甚至在它们的天然形态, 常常都不是单一分子片断, 而是由相干分子构成, 称为非均一性(多样性).发生多样性的缘由有: 氨基酸(AA )的序列分歧, 如突变体的某地位AA 改变或AA 侧链改变; 后转译发生分歧长度的多肽链; 糖蛋白分歧程度的糖基化, 如存在分歧数量的寡糖链, 寡糖链有分歧的单糖构成、序列及单糖之间的异构连接. 采取CZE, MECC, CIEF, CE-MS 可检测这些非均一性.用于心脏病的重组人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rtPA )含 4 个可能糖基.Yim [15]用 CZE 和CIEF 研讨了制备过程中 rtPA 分歧糖基化程度惹起的非均一性, 结果标明, CIEF方法要比CZE的好.还有效CZE 对人促红细胞生成素( rHuEPO )[16]、用MECC对重组人C2干扰素(IFN2C)[17]及CE-MS[18]研讨蛋白的多样性.有关蛋白的非均一性在临床中的一些利用, 如人铁传递蛋白、血清蛋白的变异、异构酶的分析等.4. 7 CE用于农药残留量的分析对农药残留物的测定国外研讨的较多.Lazer等[19]将飞行时间质谱和毛细管电泳仪联用，采取样品堆积技术进样对 Paraquat 和 Diquat 两种除草剂进行了分离，检测限低至 10- 17mol/L.Farran 等[20]采取φ(乙腈) = 50 %的磷酸-硼砂缓冲液分离出两种苯氧羧酸类除草剂.Hinsmann 等[21]通过主动在线浓缩样品，采取固相微柱以十二烷基硫酸钠(SDS)作胶束 ,添加少量乙腈 ,在13min内分离测定了水中的7种分歧品种的农药.磺酰脲类化合物是一类绝对较新的除草剂，是以这一类化合物在水和食品中的残留量的测定十分次要.Lipez Avila等[22]采取3μmODS硅胶填充柱来分离这一类化合物 ,线性范围为1～100mg/L.Mayer等报导了农药Cinosulfuron 及其副产品的毛细管电色谱的分离分析.游静等[23]对毛细管电泳在农药手性拆分的进展做了综述.4.8 CE用于纯度检测CE在国外分子生物学实验室及生物工程药厂里已广泛用作最无效的纯度检测手段.当蛋白的疏水性附近时, 它们在HPLC 柱中常常同时流出, 是以在对蛋白进行结构研讨(包含N 端序列和肽谱)之前, 必须监测从HPLC 所得肽片断的纯度.快速CE 纯度检测可节约样品和节省序列测定所需时间.因CE 和RP2 HPLC 分离机理分歧, 所以当用CE 检查由RP2HPLC 纯化制得的某一合成肽(一个峰, 纯度为 99.12% )时, 发现分出 6 个组分, 主峰纯度仅为50%.或许这就是部分基因工程产品用HPLC 检测纯度很高而实际生物活性却各批差别很大的一个缘由.至于用CE 对药厂生产及QC 作纯度检测的利用实例触目皆是, 如对胰岛素、白细胞介素、人生长激素、粒性巨噬细胞菌落刺激因子(用CIEF )等的检测.纯度检测时用CE 可检测出多肽链上单个氨基酸的差别.CE 用于纯度检测可用CZE,MECC, SDS2 CGE, CIEF 多种模式.还有文献讨论了用分歧方法(包含RP2 HPLC, IEC2 HPLC, SDS2PA GE 及CE)进行纯度检测的最无效的计谋[24].5 结论作为一种蛋白质、多肽、核酸及其他生物分子分离和分析的次要技术，近20年来，毛细管电泳的机理探索和利用研讨都取得了长足的进展，对毛细管电泳的研讨，使其分离效力和分析精度不竭提高，也使其利用领域不竭扩大，推动了生物技术的不竭发展.毛细管电泳今后发展方向仍是继续提高分辨率、速度和检测器的选择性.同时，添加主动进样安装和使之微机化、商品化.另外，将它与质谱仪更好地结合，可对生物分子特性作出更快、更精确的分析，以进一步拓宽毛细管电泳在生物领域的利用范围.。