蛋白酶的提取实验

1 实验一 产酶微生物的分离、纯化与选育

酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。

2。 蛋白酶产生菌的分离与纯化

2。1 实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.

2。2 实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。

2.3 实验仪器与材料 土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。

2。4 实验方法与步骤

2。4.1 分离

1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；

2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；

3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；

4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

2。4。2 筛选 1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。

dna提取中木瓜蛋白酶作用

DNA提取是生物学实验中常见的一项重要技术，常用的提取方法包括热水法、硅胶柱法、电泳法、离心管法等。而在这些方法中，木瓜蛋白酶作用是一种重要的消化酶，可以通过它对细胞膜和核膜进行清洗和切割，从而提高DNA的得率和纯度，以下是对该工作的详细介绍。

一、准备材料和试剂

从实验室中准备好需要的材料和试剂，其中需使用的材料有：样品（植物、水果、细胞等）、10%蒸馏水及甲醇混合液、乙醇（75%和100%）、溶液A（0.3mol/L蔗糖、0.1mol/L EDTA、0.1mol/L Tris-HCl）、木瓜蛋白酶液（2%活性）、10%SDS、溶液B（0.25mol/L

NaCl、0.1mol/L EDTA、10mmol/L Tris-HCl）、氯仿、异丙醇（IAA）、等体积混合液。

二、样品制备和处理

首先将样品在冰箱中放置30分钟后，取出后将其快速淋洗干净。将样品剪成小块或压碎，添加10%甲醇混合液，搅拌均匀后浸泡5-10分钟，待其完全变软。随后使用带滤头的玻璃瓶将材料中的液体化作细胞液，去除自主浮在液面上的杂质，并将细胞液放入离心管中。

三、离心和上清液处理

将上述样品在离心机中离心10分钟，取出上清液。将这份上清液上样（取一下即可）到另一个离心管中，并在其中悬浮50μl 2%木瓜蛋白酶液。放置于水浴中15分钟，制备DNA酶解液。随后使用枪头将上述酶解液均匀地挤到上清液中，并将其放入离心机离心10分钟，取出上清液即可。

四、上清液加工

将上述上清液加入0.15~0.2倍体积的10%SDS溶液，混合均匀，再加入等体积的溶液A，轻轻地摇匀混合。在样品内加入氯仿一半（如上清液为1mL，氯仿加500μl），轻轻摇晃混合，放置沉淀10分钟。随后将上层透明液体倒出，并加入等体积的乙醇。在70-100%浓度范围内，使用旋转振荡器轻轻摇动样品，以观察到白色的DNA沉淀。放置室温干燥即可得到提纯的DNA。

产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛

一、目的要求

1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。

2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。

3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

二、基本原理

土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。工业微生物菌种最初都来自于自然界。但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。本实验用平板分离法。

平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两个方面：

(1) 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(2) 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。

值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。

蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。

三、实验器材与试剂

1 样品

土壤样品。

2 培养基

酪素培养基配方如下：

葡萄糖0.5g

NaCl 5g

K2HPO4 0.5g

蛋白提取实验步骤:

1、 细胞总蛋白提取

A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高

蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。

B对于贴壁细胞：

a用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。

b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于 培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细 胞充分接触。

c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到 1.5ml离心管中。 C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。

2、组织蛋白提取：

A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。 加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂） 冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体 积。

B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min,期间用 移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。

C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。

注意事项

1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。

2、 全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。

3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在 RIPA使用前数分钟加

入蛋白酶抑制剂。

4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器 （200 μ l ）反复吹打， 或再加

入适量裂解液以保证充分裂解。

5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加 入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复 精品佳作，安心下载，放心使用 冻融。遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。

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