测定蛋白酶活力实验

蛋白酶活力测定实验报告
实验目的：
通过测定蛋白酶的活力，了解其功能和活性。

实验原理：
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，可以将蛋白质分解为多肽和氨基酸。

蛋白酶活力是指单位时间内酶水解蛋白质的能力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。

本实验使用的方法是酶促反应测定法。

首先，将待测蛋白酶与底物混合，反应一定时间后，停止反应并添加淀粉溶液产生反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定反应产物。

实验步骤：
1. 预备试剂：制备蛋白酶和底物的工作液，制备淀粉溶液和反应终止剂，制备碘化钾溶液。

2. 实验装置：准备滴定装置和试管架。

3. 设置实验条件：保持温度恒定，控制pH值。

4. 实验操作：在试管中加入待测蛋白酶和底物工作液，反应一定时间后，加入淀粉溶液和反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定。

5. 记录数据：记录滴定所需碘化钾的体积，计算出酶活力。

实验结果：
根据实验数据，计算出蛋白酶的活力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。

实验讨论：
分析实验结果，比较不同条件下蛋白酶的活力差异，并讨论影响蛋白酶活力的因素。

实验结论：
通过分析实验结果，得出结论，总结蛋白酶活力与其他因素之间的关系，并提出可能的应用前景。

实验总结：
总结实验过程，评价实验结果及数据，提出改进意见，并对今后可能的研究方向进行展望。

参考文献：
列出所参考的文献。

实验四 蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅，温度设置成40C) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题 六、值日
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底 物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
Na2CO3 胰蛋白酶
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
100g/ml Tyr (ml)
0
水（ml)
1.0
0.2
0.4
0.8

0.6
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为
横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
样品、对
4
5
6
照滤液 （各2支
试管）
0.6
0.8
1.0
每支管加 1ml
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸
3
40℃水 浴准确 保温10 分钟
三氯 醋酸 （ml）
3
------
酪蛋白 （ml）
-------
2
40℃水浴保温 10分钟，过滤 得滤液。
滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂 1ml，40 C保温15min)

实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。

蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。

二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。

（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。

2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。

临用现配。

4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。

取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。

实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。

2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。

4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。

将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

三支试管中反应液用滤纸过滤。

另取三支试管（一支空白。

两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。

5.数据处理。

蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。

2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。

3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。

制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。

3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。

3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。

Na2CO3 胰蛋白酶
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
100g/ml Tyr (ml)
0
水（ml)
1.0
0.2
0.4
0.8
0.6
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为
横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
样品、对
4
5
6
照滤液 （各2支
试管）
0.6
0.8
1.0
每支管加 1ml
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸
样品管
1
对照管
1
2
----浴准确保3 Nhomakorabea-------
温10分钟
----
3
------
2
40℃水浴保温10 分钟，过滤得滤 液
2、蛋白酶活力的测定
按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。
管号
1′号 (样品) 2 ′号 (对照)
酶液 （ml）
1
1
酪蛋白 （ml）
2
----
三氯 醋酸 （ml）
----
3. 酶活力计算
胰酶活力定义： 40 ℃ ， pH7.5 ，反应10min，每分 钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

蛋白酶比活力实验报告蛋白酶比活力实验报告引言：蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，广泛存在于生物体内。

通过测定蛋白酶的比活力，可以评估其催化反应的速率和效率。

本实验旨在通过比较不同条件下蛋白酶的活力，探究影响蛋白酶活性的因素。

实验方法：1. 实验材料准备：- 蛋白酶溶液：从动物组织中提取的蛋白酶溶液，浓度为10 mg/mL。

- 底物溶液：使用明胶作为蛋白酶的底物，浓度为1%。

- 缓冲液：pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

- 试管：用于混合反应液的透明试管。

- 恒温水浴：用于控制反应温度的设备。

2. 实验步骤：- 步骤一：在不同温度下测定蛋白酶的活力。

- 将5 mL蛋白酶溶液和5 mL底物溶液混合，并放置于恒温水浴中，分别设置不同温度条件（如25℃、37℃、50℃）。

- 在反应开始后的1分钟、2分钟、3分钟等时间点，取出一定量的反应液，立即停止反应。

- 使用布拉德福法测定反应液中未被水解的底物浓度，计算蛋白酶的比活力。

- 步骤二：在不同pH条件下测定蛋白酶的活力。

- 在不同pH值的缓冲液中，重复上述步骤一的实验操作。

- 测定不同pH条件下蛋白酶的比活力，并比较其差异。

实验结果：1. 温度对蛋白酶活力的影响：- 在25℃、37℃和50℃下进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.05 U/mg、0.1 U/mg和0.02 U/mg。

- 结果显示，蛋白酶的活力随着温度的升高而增加，但当温度过高时（如50℃），蛋白酶的活力反而下降。

2. pH值对蛋白酶活力的影响：- 在pH为7.4、8.0和9.0的缓冲液中进行实验，测得蛋白酶的比活力分别为0.08 U/mg、0.06 U/mg和0.04 U/mg。

- 结果显示，蛋白酶的活力在中性条件下（pH 7.4）最高，而在酸性和碱性条件下，蛋白酶的活力均降低。

讨论与结论：通过本实验，我们可以得出以下结论：1. 温度对蛋白酶活力有显著影响，适宜的温度可以提高蛋白酶的催化效率，但过高的温度会导致酶的变性，从而降低活力。

五。结果及分析
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社

3
在实际应用中，蛋白酶活力测定具有广泛的应用 价值，如食品工业中蛋白质水解、洗涤剂生产中 的酶催化反应等。
研究展望
随着生物技术的不断发展，蛋白酶活力测定技术也在不断改进和完善。未来，可以通过开发 新型的蛋白酶活力测定方法，提高测定灵敏度和特异性，进一步拓展其应用范围。
在研究蛋白酶的底物特异性、抑制剂作用机制等方面，可以结合计算机模拟技术、光谱学技 术等手段，深入探究酶的催化机制和作用机理。
随着蛋白质组学和代谢组学研究的深入，蛋白酶活力测定在生物标志物发现、疾病诊断和治 疗等方面的应用将更加广泛。同时，随着人类对生物大分子结构和功能的认识不断深入，蛋 白酶活力测定在药物设计和发现等领域也将发挥更加重要的作用。
THANKS
感谢观看
数据记录与处理
06 详细记录实验数据，并进行必
要的计算和处理，以得出实验 结论。
实验操作技巧
温度控制
确保酶反应在恒温条件下进行，以减 少温度对酶活力的影响。
02
pH调节
使用适当的缓冲液调节反应液的pH值， 以保证酶活力的稳定。
01
03
避免污染
在整个实验过程中，要严格控制实验 环境，避免样品和试剂受到污染。
对照实验
进行对照实验时，要确保对照组与实 验组条件一致，以消除误差对实验结 果的影响。
05
04
精确测量
在实验过程中，要使用精确的测量工 具和方法，确保实验数据的准确性。
05
结果分析与解读
结果分析
酶活力单位
通过实验数据，计算出蛋白酶的酶活力单位， 以评估酶的催化活性。
酶促反应速率
分析酶促反应速率，了解酶促反应的进程和 快慢。
底物浓度与酶活力的关系

一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

2. 了解蛋白酶的特性和作用。

3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。

二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。

蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。

2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。

3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。

（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。

（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。

（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。

（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。

（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。

6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。

（2）分析蛋白酶的特性和作用。

五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。

（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。

2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。

（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。

六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。

2、深入了解酶的活力和比活力的概念。

二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。

2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。

3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。

4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。

5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。

三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。

（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。

（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。

以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。

管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。

将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。

实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。

二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。

三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。

使用时用2倍体积的水稀释。

2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。

3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。

4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。

5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。

6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。

7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制编号0 1 2 3 4 5 6 7 80 1 2 3 4 5 6 7 8标准酪氨酸溶液(mL)[100g/mL]水(mL) 10 9 8 7 6 5 4 3 2稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。

测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。

2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。

其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。

本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。

实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。

产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。

原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。

使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。

试剂1. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。

再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。

冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。

使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。

实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。

二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。

在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。

三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。

0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。

０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。

2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。

５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。

四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。

２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。

在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。

00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。

00ml５％三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。

5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。

实验二十一 蛋白酶活力的测定
实验目的
掌握测定蛋白酶活力的原理和方法
学习酶活力的计算方法
蛋白酶概述
内肽酶 外肽酶 二肽酶
氨肽酶 羧肽酶
蛋 白 酶
中性蛋白酶
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生

焙烤行业； 啤酒工业； 医药工业； 纺织工业； 皮革工业； 饲料工业；
2. 酶液的制备（已制备）
3. 活力测定 3.1 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴，5 min； 3.2 按照下表操作，进行酶催化反应；
0
待测酶液 0.4 M 三氯乙酸 2% 酪蛋白溶液 0.4 M 三氯乙酸 1 mL 2 mL 1 mL ——
1
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
2
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
40℃恒温水浴锅保温，20 min 测定680 nm处吸光值 酶活力单位定义： 40℃，最适pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的 酶量为1U。 计算公式
4 酶活力= 10 ×K× n×A680
思考题

该方法测定蛋白酶活力的误差来源主要有哪些
5. 1.398中性蛋白酶 (neutral protease) 6. 2% 酪蛋白溶液（casein solution） 7. 标准酪氨酸溶液（100 μg mL-1）
仪器
分光光度计
试管
烧杯 移液管
恒温水浴锅
离心机 漏斗
实验步骤
1. 标准曲线 （已完成） 参考标曲，求出K值,K=94. n=20 000
1.398中性蛋白酶

分子量约43kD
最适pH 7. 2- 7. 4,

蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。

2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。

3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。

制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。

3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。

3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。