胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取的分离纯化Last revised by LE LE in 2021胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。

其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。

纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。

综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。

关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1 工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。

一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。

（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。

用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。

（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。

（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。

球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分离技术有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。

通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。

当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。

丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。

2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。

一、实验目的1. 了解胃蛋白酶的化学性质和生理功能。

2. 掌握从胃黏膜中提取胃蛋白酶的方法。

3. 学习实验操作技巧，提高实验技能。

二、实验原理胃蛋白酶是一种消化酶，主要存在于胃液中，能将蛋白质分解成肽和氨基酸。

本实验通过从新鲜猪胃黏膜中提取胃蛋白酶，探讨其提取方法及活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜猪胃黏膜、生理盐水、蒸馏水、氢氧化钠、硫酸铵、乙酸、酚酞指示剂、标准蛋白质溶液、考马斯亮蓝G-250染料、酶标仪、离心机、冰箱、烧杯、玻璃棒、移液管、滴定管、电子天平等。

2. 实验试剂：胃蛋白酶提取液、胃蛋白酶活性测定液、胃蛋白酶标准曲线、缓冲液等。

四、实验步骤1. 胃蛋白酶提取液的制备（1）将新鲜猪胃黏膜洗净，去除脂肪和杂质。

（2）将胃黏膜剪成小块，放入烧杯中，加入适量的生理盐水，用玻璃棒搅拌。

（3）将搅拌后的胃黏膜液过滤，收集滤液。

（4）向滤液中加入氢氧化钠溶液，调节pH至7.0。

（5）将溶液在室温下静置30分钟。

（6）加入硫酸铵溶液，使蛋白质盐析，沉淀蛋白质。

（7）将沉淀物用蒸馏水洗涤，直至无色。

（8）将洗涤后的沉淀物溶于适量的乙酸溶液中，制成胃蛋白酶提取液。

2. 胃蛋白酶活性测定（1）配制标准蛋白质溶液，用考马斯亮蓝G-250染料进行比色，绘制标准曲线。

（2）取一定量的胃蛋白酶提取液，加入适量的缓冲液，使pH值调至7.0。

（3）取标准蛋白质溶液和胃蛋白酶提取液，分别加入适量的胃蛋白酶活性测定液。

（4）将混合液置于37℃水浴中保温15分钟。

（5）取出混合液，加入适量的酚酞指示剂，用NaOH溶液滴定至终点。

（6）根据滴定结果，计算胃蛋白酶活性。

五、实验结果与分析1. 胃蛋白酶提取液的制备通过实验，成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取液呈淡黄色。

2. 胃蛋白酶活性测定根据实验结果，绘制出胃蛋白酶标准曲线。

在实验条件下，胃蛋白酶活性为（XX±XX）U/mg。

六、实验结论1. 本实验成功从新鲜猪胃黏膜中提取出胃蛋白酶，提取方法简单可行。

综述评论　各类型胶原的分离方法郭　云北京奥弛坦登新技术公司,北京,100084张景锡北京科技大学材料学院,北京,100084彭必先中国科学院理化技术研究所,北京,1001011　Ⅰ型胶原1.1　从成年家兔提取[1]由耳静脉注入空气致死,迅速剥下兔皮,去毛及皮下脂肪,称重,然后将皮肤放入冰中(下述各步骤除特殊说明外,均在4℃下进行)切碎,用绞肉机将其绞成肉泥状,置入烧杯中,加入2.5倍量的中性盐提取液(0.1M T ris ,0.2M NaCl ,0.1m M E DT A ,pH 7.6)。

搅拌2～3h 后,以12,000g (g -重力加速度)离心30min ,弃上清液,沉淀部分加入2.5倍量的3%冰醋酸(H Ac )溶液,抽取搅拌过夜;以20,000g 离心90min 。

所得胶原经盐析沉淀、低离子强度沉淀、加热致凝胶化、超速离心、三氯醋酸-乙醇沉淀5个步骤进行胶原纯化。

Ⅰ型胶原的纯化:由于各型胶原可被不同浓度NaCl 所沉淀,将胶原溶液对pH 7.3,0.1M T ris 缓冲液透析,更换透析液直至平衡,液体的pH 仍维持中性;加入5.1M NaCl 至终浓度为1.7M ,搅拌过夜;以18,000g 离心30min ,弃沉淀(此部分为Ⅲ型胶原)。

上清液加入4.0M NaCl 至最终浓度为2.5M ,搅拌过夜。

以22,000g 离心30min ,沉淀溶解于1%H Ac 溶液中,对1%H Ac 透析,然后反复此过程。

最后所得胶原溶解于1%H Ac 溶液中。

对1%H Ac 反复透析,真空冷冻干燥,称重,保存于-20℃冰箱中。

1.2　从人胎盘提取[2]取新鲜正常人胎盘2只,胎盘去脐带和羊膜、捣碎、匀浆;4℃下胃蛋白酶消化20h (每20g 湿重组织加入0.05%胃蛋白酶、0.5m ol/L 醋酸100m L );清化上清液(酸性)中加入NaCl 至1.0m ol/L ,沉淀为胶原混合物;随后在中性条件下分别以1.5m ol/L 、2.5m ol/L NaCl 盐析,反复数次分别得Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的初纯品;用DE -52柱层析去除酸性大分子,得到纯化的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。

胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。

胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。

以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。

首先，选择合适的菌种进行培养。

常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。

菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。

然后，进行菌种的发酵过程。

将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。

发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。

接着，进行胃蛋白酶的提取。

发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。

胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。

最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。

采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。

纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。

在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。

2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。

3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。

4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。

综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。

通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。

酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。

关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究王晨1，吴晖1，李晓凤1，刘冬梅1，赖富饶1，仇宏伟2（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）（2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109） 摘要：以干鸡骨粉为原料，研究了骨胶原的酶法提取工艺。

实验结果表明：原料需用1.0 mol/L HCl脱钙处理2 d，用正己烷脱脂后，再利用胃蛋白酶进行酶解。

最佳酶解工艺为：加酶量150 U/g、pH值1.7、37 ℃条件下处理120 min，然后在液固比6:1的情况下用水抽提5 h。

在上述条件下，骨胶原提取率可达18.4%，其蛋白质含量为54%。

关键词：骨胶原；提取；酶解中图分类号：TS201.2；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)12-1300-04Enzymatic Extraction of Collagen from Poultry Bone by PepsinWANG Chen1, WU Hui1,LI Xiao-feng1,LIU Dong-mei1, LAI Fu-rao1,QIU Hong-wei2(1.College of Light Industry & Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)（2.College of Food Science & Engineering, Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China)Abstract: Enzymatic treatment to improve the extraction of collagen from chicken bone powder was explored in this paper. The rawmaterials was decalcified by 1.0 mol/L HCl for 2 days, defatted by hexane and then hydrolyzed by pepsin under the following optimalconditions: enzyme dosage of 150 U/g, reaction time of 120 min, pH value of 1.7, and reaction temperature of 37.℃ For the extraction ofcollagen from the enzymatic hydrolyzate, the best liquid/solid ratio and extraction time were 6:1 and 5h respectively. Under these conditions, theextraction rate and protein content of the collagen from poultry bone were of 18.4% and 54%, respectively.Key words: bone collagen; extraction; enzymatic hydrolysis骨胶原是存在于人体和动物体内的一种胶原蛋白，是人体关节软骨、骺软骨和骨小梁的主要成份，占骨骼有机物的80%以上[1~2]。