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论耐热性毛霉菌株的筛选及酶学性质qI{,z—l.第1期1998年1月,印穹,,79j吖1仃一\吣7中国调味品2一弓f№tJm1998论耐热性毛霉菌株的筛选及酶学性质垫堂蛰-'7-527L7L?(华中农业大学食品科技系武汉42~q0)l摘要】从湖北,河南手地收集,分离的6l抹霉菌中,筛选母到一抹靛良好发酵生产腐乳的耐热性毛霉I-I,菌棘.谴菌棘的生生长青适矗为30～40℃;在35℃条件"F~l-养2d,其中性蛋白酶活力腐乳是我国特有的发酵食品,在许多地方都有生产.它具有风味独特,营养丰富,价格便宜等特点.它既可调味,也能佐餐,深受国内外消费者的喜爱,因而存在着较大的销售市场和消费潜力.腐乳生产的历史悠久【.五十年代中期以来,由于搞清了发酵菌种问题而开始应用人工接种的革新法(新法)生产腐乳.毛霉是新法生产腐乳的主要菌种【2J.它具有菌丛细长柔软,酶系丰富,无毒无害,不产生怪昧异色等优点,但其生长温度一般都在15～25℃,不能在炎热季节用于腐乳生产.为了解决在炎热季节生产腐乳所需的菌种问题,我国从八十年代初期开始开展了大量的耐热菌种选育工作.但所选菌种的耐热程度一般都在35℃以下,不能满足腐乳生产的需要.本文就耐热菌种的筛选及酶学性质进行了研究.l材料与方法1.1菌种来源1.1.1发霉豆制品收集湖北,河南等地的霉豆腐,霉干张,豆渣等,从中分离得到毛霉24株,1.12稻草收集武汉市郊的新鲜稻草,将豆腐块置于其上,富集得到毛霉11株,根霉15株. 1.1.3酒曲从湖北所产一酒曲中分离得到毛霉2株,根霉3株.1.1.4本研究室华中农业大学食品微生物研究室现有的腐乳发酵用根霉1株.1.2培养基1.2.1酪蛋白(干酷索)琼脂培养基干酪索4.0先用20ml0.1mol/LNaOH溶液溶解后,加20g琼脂,再加蒸馏水煮沸溶解并定容至1000ml,分装后灭菌备用.1.2.2麸皮豆粉培养基麸皮9.O黄豆粉(过加目筛)1.0g,水10ml,装入250ml三角瓶中,拌匀,灭菌后及时振散备用.1.23马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基见参考文献l.1.2.4豆浆培养基取黄豆100.0g,用水泡胀后,放入多功胡巅,理学硕士,讲师,现在河南省卫生防疫站工作.拯藩骶玑渤弩言蝴速关前第1期专论与综述论耐热性毛霉菌株的筛选及酶学性质3 能果汁机的料杯中.并加少量水,然后捣碎制浆.用双层纱布过滤.反复加水,捣碎,过滤.共得豆浆1000rd,然后分装,灭菌,备用.1.2.5豆腐块培养基将市售豆腐(石膏点制)切成2×3xlena小块,装入250ml三角瓶中.每瓶2块.灭菌后备用.以上培养基有条件均为121℃半小时灭菌.1.3主要仪器电子天平:1702型.德国Sartarius;分光光度计:721型.上海第三分析仪器厂;控温摇床:e一26型,美国New BrunswickScientificCo.;生化培养箱:IR}卜150B型,广东省医疗器械厂;相差显微镜附配套照像系统:BH一2 型.日本OlympusoptCo.,Ltd..1.4主要药品L一酪氨酸:生化试剂.上海长江生化制药厂;葡萄糖:化学纯,北京化学试剂二厂;3,5一二硝基水杨酸(DNS):化学纯,北京西中化工厂;橄榄油:化学纯,上海化学试剂站分装厂;福林一酚(Follnpheno1)试剂lJ用于蛋白酶活力的测定;聚乙烯醇(P,v.P)橄榄油乳化液[l:用于脂肪酶活力的测定.DNS试剂【】:用于还原糖含量及糖化酶及活力的测定.1.5菌种筛选1.5.1初筛用接种环蘸取少许孢子.分别将各菌株点种在酪蛋白琼脂乎板培养基上,并置于35℃条件下培养2出然后观测各菌株的菌落直径,菌丛高度和透明圈大小等.1.5.2复筛将初筛所得菌株的孢子悬液,分别接种到麸皮豆粉培养基中,在35℃条件下培养2d.接着取一定量的鲜曲.制备其中性蛋白酶的粗酶液后.测定各菌株的酶活高低. 1.5.3发酵试验将复筛所得菌株的孢子悬液.涂布接种到豆腐块培养基上,在35℃条件下培养2d. 观测其发酵情况.1.6粗酶液制备1.6.1固体曲的蛋白酶粗酶液取2.0g固体曲(麸曲,菌膜).研磨后分别用20rd0.1md/LpH2.6的乳酸一乳酸钠缓冲液,0.1mol/LpH7.2的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液和0.05mol/L硼酸根pill0.0的硼砂一氯氧化钠缓冲液,在加℃水浴中浸提1h,并间断搅拌.经滤纸过滤后即得相应的酸性,中性和碱性蛋白酶的粗酶液.16.2液体曲的蛋白酶粗酶液直接将液体曲用滤纸过滤即得其粗酶液.1.6.3脂肪酶粗酶液同液体曲蛋白酶粗酸液的制备方法.1.6.4糖化酶粗酶液基本同固体曲蛋白酶粗酶液的制备方法,但用0.1mol/LpH4.6的醋酸一醋酸钠缓冲液作浸提液.1.7酯活的测定1.7.1蛋白酶活力的测定采用Folinphenol法_4J.分别用相应pH值(pH2.6,pH7.2和pill0.0)的缓冲液配制酪蛋白溶液作底物,测定酸性,中性和碱性蛋白酶活力高低.定义在加℃条件下,每lmin 水解酪蛋白产生lpg酪氨酸所需的酶量为1 个酶活单位.1.7.2脂肪酶活力的测定采用乳化撇榄油法].定义在加℃,pH7.2条件下,每lmin水解脂肪产生lpmol4中国调味品总第227期脂肪酸所需酶量为1个酶活单位.1.7.3糖化酶活力的测定采用DNS法【t.定义在加℃,pH4.6条件下,每1h水解淀粉产生lrag葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位.2结果与分析2.1选定的菌株经初筛,复筛和发酵试验,HI菌株在35℃条件下生长,发酵良好.且其菌丛细长柔软,色白无怪味,具有较高的蛋白酶活力.因而被选为进一步研究,利用的腐乳菌种.其有关陛状见表1.表1菌株的性状【在35E条件下墙彝*:在酪蛋白琼脂平扳上培养;*-:在麸皮豆粉培养基上培养i-*-:在豆腐块培养基上培养.经鉴定【,HI菌株为毛霉(Mucor印.),暂命名为毛霉HI菌株.2.2H|菌株的温度适应性将毛霉H菌株的孢子悬液涂布于三角瓶中的PDA培养基上.分别置于不同温度下培养,每隔12h观测一次.其生长情况见表2.表2H菌株在不同温度下的生长情况显然,H|菌株在45℃以下都能生长,且随着温度的升高,它的生长速度加快,老化的速度也随之加快.其中在30～40℃,HI菌株的生长速度较快.老化较慢.所以HI菌株是一生长温度范围较大的耐热菌株.2.3H|菌株的蛋白酶组城将毛霉HI菌株的孢子悬液接种于麸皮豆粉培养基中,在35℃条件下培养2d.然后分别制备其酸性,中性和碱性蛋白酶的粗酶液,并测定其相应的酶活.其结果见表3.表3菌株蛋白酶的组成酶类煞燕碱性蛋白酶0酶活(g干曲)129.0185.9表3显示.HI菌株具有酶活力相近的酸性和中性蛋白酶.这有利于HI菌株在偏酸性的较大的DH值范围内分解蛋白质.2.4H|菌株的脂肪酶和糖化酶活力分别用豆浆培养基和麸皮豆粉培养基,在接种毛霉菌株的孢子悬液后,分别在第1期专论与综述论耐热性毛霉菌株的筛选及酶学性质5 35"C条件下振荡(200r/rnln)和静止培养2d.然后分别制备脂肪酶和糖化酶的粗酶液测定其相应的酶活.其结果见表4.表4I-L,由表3和表4可知,HI菌株具有较丰富的酶系组成.这有利于豆腐坯主要成分的降解,以保证腐乳的品质.2.5HI菌株的产酶(中性蛋白酶)进程在豆腐块培养基上,涂布接种毛霉H菌株的孢子悬液,在35℃条件下培养,每隔12h剥取毛坯上的菌膜(带少量坯基).制备中性蛋白酶的粗酶液,测定其酶活力.其产酶进程如图1.3蠡菪驽圉1H'菌株产酶(中性蛋白酶)进程从图1可看出,HI菌株在豆腐坯上生长到第48h达到产酶高峰,至第60h便迅速下降.所以在腐乳生产过程中,可在48～60h期间中止HI菌株的发酵而进行后续工艺.2.6cMg2对}I4菌株产酶【中性蛋白酶】的影响以豆浆培养基为对照.并以它为基础,分别添加CaSO4?2H20和MgSOg7H20,配成不同cd和Mg2浓度的豆浆培养基,灭菌后接种毛霉}I4菌株的孢子悬液,在35℃,200r/rain条件下培养2do每处理三次重复, 每重复50ml培养基.培养结束后分别制备其中性蛋白酶的粗酶液,测定其酶力.其结果见图2.3蠡菪舅子.'l00'30予(%)圈2c',M对H'菌株产酶{中性蛋白醵】的影响由图2可看出,在试验范围内,0.1O%～0.50%cd能促进}I4菌株的中性蛋白酶活力,其中0.40%Ca2使其中性蛋白酶活力达最大值(210.050ml液体曲);0.10%～0.44%t~也能提高HI菌株的中性蛋白酶活力.其中0.20%Mg2使其中性蛋酶活力达最大值(2O5.ov/5ona液体曲).2.7(起始)pH值对}I4菌株产酶(中性蛋白酶)的影响同样以豆浆培养基为基础,分别调成不同的oH值.接种后在35℃,200r/win条件下培养2d.然后分别制备其粗酶液,测定其中性蛋白酶活力.其结果见图3.200嚣0嚣loo掣5o3456789pH值圉3m-I值对H'菌株产酶伸性蛋白酶】的影响显然,pI-I5～7是H菌株产酶(中性蛋白酶)的适宜的pH值.3讨论3.1腐乳发酵菌种的耐热性据现有的报道[8.9.1o】,所谓的耐热菌种,6中国调味品总第227期其耐热程度大多在35℃以下.本研究筛选的毛霉H菌株.其生长适温在30--40℃,故为目前最耐热的腐乳发酵菌种之一.实际上,我国腐乳产地的夏季室内温度各不相同, 因此,耐热菌种的选育和应用应结合腐乳产地的具体情况.江南地区是腐乳的主产地. 毛霉菌株符合该地对耐热菌种的需要.3.2腐乳发酵菌种的酶系组成豆腐(以大豆为原料)中含有16.0%蛋白质,7.2%脂肪和0.1%碳水化物.三者是豆腐的主要有机质成分¨.腐乳发酵菌种应具有相应的酶系.以分解豆腐相应的成分. 形成腐乳的鲜味和其它风味,提高腐乳的营养价值.毛霉菌株具有相应的酶系,符合腐乳发酵对菌种酶系的要求.由于多种原因,使得确定发酵菌种的几种主要酶的酶活指标颇为困难.但为了提高菌种选育水平,应根据腐乳不同品种的工艺特点,确定发酵菌种的酶活指标,特别是蛋白酶的酶活指标.这方面的工作尚待开展.3.3凝固剂对菌种的影响腐乳发酵所用的豆腐坯一般是由盐卤或石膏凝固.它们作凝固剂各有所长.其中用盐卤凝固的豆腐坯中Mg2较多,含量一般为0.1%～0.2%;用石膏凝固的豆腐坯中Ca2+较多.含量一般为0.3%～0.4%t".所以.不论以盐卤还是以石膏作凝固剂点制的豆腐,均利于H}菌株中性蛋白酶的作用. 参考文献l陈陶声.中国酿造技术的过去,现在与将来(下),中国调味品,1988(4):62扬淑嫒等.新编大豆食品.北京.中国商业出版社,1989180～2063祖若夫等.微生物实验教程.上海.复旦大学出版社.1993.2814堵葛健,壬正祥.工业微生物实验技术手册. 北京.中国轻工业出版社,1994.206-2095中山大学生化微生物学研究室.生化技术导论.北京.人民教育出版社,197857～596北京大学生物化学教研室.生物化学实验指导.北京:人民教育出版社.1979.22-247胡巅,赵学慧.耐热性毛霉的选育及鉴定.信阳农专.1997(3):6～88常余林.新春3号腐乳菌种的选育.调味副食品科技.1981(9):209陈娇娣,陈绪嫦.腐乳生产的高温菌种的筛选结果.食品科学,1993(3):50-5210邓席芳等.耐高温腐乳毛霉菌种选育及产酶条件研究.中国酿造,1996(1):27-30n扈文盛食品常用数据手册.北京.中国食品出版社,1987.446-456收稿日期:19978上接第31页)表l样品分析结果参考文献1日本药学会编着.张洪样主编.卫生试验法. 注解.北京.华文出版社,1995:2292GB5009.39—85.食品卫生检验方法(理化部分),北京中国标准出版社,1986:1533志Itl~--化学辞典东京,森北出版株式会社,1981:9844D咖iMB.~2shooCJ.ShahSAeta1.JA OACInt,1989,72(6):953收稿日期:1997.9。
毛霉蛋白酶的组分特性及对大豆蛋白水解的研究潘进权 罗晓春 谢明权(华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510641)摘 要 毛霉是腐乳酿造的主要微生物之一,其分泌的蛋白酶对大豆蛋白具有较高的水解效率以及对蛋白水解物良好的脱苦效果,因此在大豆蛋白水解加工方面显示出很好的应用前景。
本研究采用多种蛋白纯化的方法从毛霉胞外分离纯化出三种不同的蛋白酶组分。
在探讨了各组分蛋白酶性质的基础上,考察了各种蛋白酶组分对大豆蛋白的水解效果。
结果显示,纯化得到的碱性蛋白酶组分Pb1对大豆蛋白具有相对较强的水解能力,而酸性蛋白酶对大豆蛋白水解能力较差,碱性蛋白酶与酸性蛋白酶之间具有良好的协同作用。
关键词 雅致放射毛霉 蛋白酶 性质 大豆蛋白 水解中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2009)05-0031-05毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种之一,在腐乳生产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内的大豆蛋白。
已有的研究发现,腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在,具有相当高的水解程度,并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽[1-2];而对众多腐乳产品的感官分析也表明,腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。
综合以上两点来看,毛霉蛋白酶在解决植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解方面存在的技术难题,如水解率低、水解产物具有强烈的苦味等具有很大的潜力。
与其它真菌(如米曲霉、青霉、红曲霉等)相类似,毛霉由于长期在高蛋白的培养基上生长驯化,因此,它具有合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力[3],而且其胞外蛋白酶系对于大豆蛋白具有很好的适应性,显示出相当高的水解效率[4]。
然而,对毛霉胞外蛋白酶系的深入研究却一直以来为国内外学者所忽视,仅有极少量的报道初步探讨了毛霉胞外蛋白酶的构成,以及粗酶液对大豆蛋白的水解效果,几乎没有报道深入到该蛋白酶系的组分构成以及各组分的催化特性。
为了较全面的了解毛霉胞外蛋白酶系的构成,本研究深入探讨了毛霉胞外蛋白酶系的组分构成,各蛋白酶组分的催化特性以及对大豆蛋白的水解特性以期为毛霉胞外蛋白酶的应用提供借鉴。
毛霉ZG-2菌株产蛋白酶条件优化巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【摘要】对毛霉ZG-2菌株的产蛋白酶条件进行优化,以便于生抽大曲的大规模生产.结果表明,在大豆粉40％、麸皮60％、加水100％(V/m)、温度40℃条件下,制成的大曲蛋白酶活性最高,其中酸性蛋白酶酶活2 314 U/g、中性蛋白酶酶活4 602 U/g、碱性蛋白酶酶活1 352 U/g;加120 g/L食盐水溶液进行稀醪发酵60 d,原料蛋白质转化率最高,达79.3％.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2013(042)004【总页数】4页(P164-167)【关键词】蛋白酶;毛霉ZG-2;稀醪发酵【作者】巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】TS201.25酱类是开门七件事之一，在中国人日常生活中具有重要的作用。
随着生活水平的不断提高，人们对酱类的质量要求也越来越高。
随着科学的发展，酱类的发酵技术也在不断提高，先后经历了大曲高盐稀醪发酵、无盐固态发酵、低盐固态发酵、低盐固态混菌共酵。
几十年来，研究人员一直追求蛋白酶活性的提高、原料转化率的提高、多菌共酵［1］、多酶互作［2］、产品色香味体具佳［3］。
太空育种是当前开发和培育新的优良菌种的有效研究方法之一［4－5］，从神舟6号飞船搭载的大曲中，筛选出8个优良的毛霉属菌株，其蛋白酶活性远高于出发菌株，将蛋白酶活性较高的毛霉ZG－2菌株，与曲霉属的米曲霉相配套，进行了生抽生产的中试，取得了良好的结果［6－7］，其产品的色、香、味、体经过模糊综合评价均达到较满意的水平，各项质量指标均高于国家标准，原料转化率也有所提高。
实验八毛霉的分离和豆腐乳的生产一、实验目的1、学习毛霉的分离和纯化方法。
2、掌握豆腐乳发酵的工艺过程。
二、实验原理豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。
民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。
豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。
三、试剂与器材3.1菌种：毛霉斜面菌种。
3.2 培养基（料）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），无，菌水、豆腐坯、红曲米、面曲、甜酒酿、白酒、黄酒、食盐。
3.3仪器和器具培养皿、500mL三角瓶、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱。
四、实验内容4.1毛霉的分离：配制培养基→毛霉分离→观察菌落→显微镜检。
4.2豆腐乳的制备悬液制备→接种孢子→培养与晾花→装瓶与压坯→装坛发酵→感官鉴定五、实验步骤5.1毛霉的分离5.1.1配制培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。
经配制、灭菌后倒平板备用。
5.1.2 毛霉的分离从长满毛霉菌丝的豆腐坯上取小块于5mL无菌水中，振摇，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20℃培养1～2d，以获取单菌落。
5.1.3 初步鉴定5.1.3.1菌落观察：呈白色棉絮状，菌丝发达。
5.1.3.2显微镜检：于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。
若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。
5.2 豆腐乳的制备5.2.1 悬液制备5.2.1.1毛霉菌种的扩繁将毛霉菌种接入斜面培养基，于25℃培养2d；将斜面菌种转接到种子培养基中，于同样温度下培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。
霉菌在食品制造中的应用霉菌在自然界分布很广，也是人类利用最多的微生物类群，绝大数霉菌能把加工原料中的淀粉、糖类等碳水化合物、蛋白质等含氮化合物及其他种类的化合物进行转化。
如在食品工业中可利用霉菌生产豆腐乳、酱油、食醋等发酵食品，生产红曲色素、柠檬酸等食品添加剂，生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等酶制剂。
一、霉菌与淀粉的糖化糖化是指淀粉在糖化剂（曲或酶）的作用下，转化为可发酵性糖即葡萄糖和麦芽糖的过程。
霉菌的糖化是通过其产生的淀粉酶进行的。
通常情况是先进行霉菌培养制曲。
淀粉原料经过蒸煮糊化加入种曲，在一定温度下培养，曲中由霉菌产生的各种酶起作用，将淀粉分解成糖等水解产物。
（一）糖化原理糖质原料只需使用含酵母等微生物的发酵剂便可进行发酵；由于酵母本身不含糖化酶，不能直接利用淀粉，所以含淀粉质的原料还需将淀粉糊化，使之变为糊精、低聚糖和可发酵性糖。
糖化剂中不仅含有能分解淀粉的酶类，而且含有一些能分解原料中脂肪、蛋白质、果胶等的其他酶类。
曲和麦芽是酿酒常用的糖化剂，麦芽是大麦浸泡后发芽而成的制品，西方酿酒糖化剂惯用麦芽；曲是由谷类、麸皮等培养霉菌、乳酸菌等组成的制品。
一些不是利用人工分离选育的微生物而是自然培养的大曲和小曲等，往往具有糖化剂和发酵剂的双重功能。
（二）糖化菌种在生产中利用霉菌作为糖化菌种很多。
根霉属中常用的有日本根霉、米根霉、华根霉等；曲霉属中常用的有黑曲霉、宇佐美曲霉、米曲霉和泡盛曲霉等；毛霉属中常用的有鲁氏毛霉。
红曲属中的一些种也是较好的糖化剂，如紫红曲霉、安氏红曲霉、锈色红曲霉、变红曲霉等。
二、霉菌与发酵豆制品发酵豆制品包括酱油、豆酱、豆豉及各种腐乳等，都是用大豆或大豆制品接种霉菌发酵后制成的。
下面以酱油和腐乳为例来介绍霉菌的发酵作用。
（一）酱油酱油是一种常用的成味调味品，以蛋白质原料和淀粉质原料为主，经微生物发酵而成。
酱油不仅有食盐的咸味、氮基酸钠盐的鲜味、糖及其醇甜物质的甜味、有机酸的酸味等，还有天然的红褐色色素。
实验一：从毛霉中提取蛋白酶及分离方案
组员：周云线周丽玲陆江妙
1 实验原理
毛霉又叫黑霉、长毛霉接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。
以孢囊孢子和接合孢子繁殖菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。
毛霉常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。
许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
工业中利用其蛋白酶以酿制腐乳、豆豉等。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清等。
酶活定义：在4 0℃， p H7.2条件下， 1分钟内水解酪蛋白产生 l微克酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。
蛋白酶水解络蛋白，其产物络氨酸能在碱性条件下使福林-酚试剂还原，生产钼蓝与钨蓝，在680nm下测定其吸光度，可求得蛋白酶活力。
考马斯亮蓝是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。
一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。
而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，这种现象称为盐析。
在蛋白质的盐析中，硫酸铵最为常用，这是由于硫酸铵在水中的溶解度最低而且温度系数小不影响酶活性，分离效果好。
2 仪器
恒温培养箱、振荡摇床、恒温振荡器、离心机、722分光光度计、pH计、恒温水浴锅
3培养基
斜面培养基PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000mL 煮沸半个小时或高压蒸煮20分钟，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10mL（视试管大小而定），121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
固体培养基：麸皮10g，水12mL，自然pH值，适量装入250mL三角瓶中，l2l℃灭菌30min后趁热及时摇散，备用。
液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖10g、氯化镁2g、磷酸二氢钾2g，250mL锥
形瓶装样量50mL，l2l℃灭菌30min，培养72h。
4 相关溶液
福林-酚试剂、标准酪氨酸溶液（1000mL）、pH7.2磷酸缓冲液（1000ml）、2%酪蛋白溶液（500mL）、0.4mol/L三氯乙酸溶液（1000mL）、0.4mol/L碳酸钠溶液（1000mL），0.2mol/LHCL（1000mL）、1mg/mL牛血清蛋白标准溶液
考马斯亮蓝染色液：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
5 方法
（1）孢子菌悬液（血球计数板计数，106个/mL），斜面培养基培养48h后，用5mL生理盐水洗脱下孢子，将孢子菌悬液吸至无菌试管（无菌棉花或纱布过滤），梯度稀释法稀释至106个/mL。
（2）固体培养基培养三角瓶接入5%孢子菌悬液，28℃培养72h（每24小时翻动一次，用干净玻璃棒翻动并轻微搅打）。
（3）摇床培养，冷却后按5%接种量接入孢子菌悬液，150r/min ，28℃培养72h。
（4）粗酶液的制备
发酵液：将发酵好的液体培养物在3000rpm下离心20分钟，取上清液即为粗酶液。
固体培养基：将生长着毛霉的三角瓶加蒸馏水/0.3mol/L盐水/pH7.5缓冲液100mL拌匀，匀浆机搅拌破碎，40℃恒温水浴锅内浸泡1h，过滤，即得粗酶液。
加蒸馏水100mL拌匀，置于40℃恒温水浴锅内浸泡1h，取出后用四层纱布过滤得粗酶液，供测定酶活用。
（5）蛋白酶活力的测定
①标准曲线的绘制取九支试管按下表将标准络氨酸溶液进行稀释。
从上述各试管中各取1mL,分别加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液、1mL福林-酚试剂，于40℃水浴中显色20min,在680nm波长下测定吸光度，绘制标准工作曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当于的络氨酸质量（μg）（即为K值）。
②蛋白酶活力的测定取4支10mL离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中1支为空白管，3支为平行试管。
置于40℃水浴中预热3～5min，在3支平行试验试管中分别加入1mL2%络蛋白溶液，准确计时保温10min。
立即加入2mL0.4mol/L 三氯乙酸溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。
分别吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林-酚试剂，摇匀，置于40℃水浴中
显色20min。
空白试管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，，再加入1mL2%络蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。
以下操作与平行试验管相同。
以空白管为对照，在680nm波长下测定吸光度，取其平均值。
计算：蛋白酶活力=(K×A×4×N)/(10×m)
式中：K—在40℃、pH7.2条件下，单位质量的酶粉1min水解络蛋白为络氨酸的蛋白酶活力；A—平行试验管的平均吸光度；4—李希光中反应液的总体积，mL；10—反应时间，min；N—稀释倍数；m—酶粉称取量，g。
(6)蛋白质测定方法
①
以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
②样品中蛋白质含量的测定取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
然后利用标准曲线求出样品蛋白质含量。
（7）蛋白酶反应最适pH 将蛋白酶液与酪蛋白溶液置于不同pH值的磷酸钠缓冲液中，在40℃下测酶活力，以确定最适pH。
（鉴定为酸性、中性、还是碱性蛋白酶）
（8）蛋白酶初步纯化
①硫酸铵分级沉淀取一定体积的粗酶液，分成8份，在冰水浴中缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为30%、40％、50%、60%、70%、80%、90%，充分溶解后离心，分别测定上清液和沉淀酶活，绘制硫酸铵盐析曲线。
②透析 4℃下透析24小时，测定酶活和总蛋白含量。
把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。
在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸10分钟。
用蒸馏水彻底清洗透析袋。
放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋是必须戴手套。
用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。
含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。
为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。
透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。
小量体积溶液的透析，
可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。
