钙蛋白酶抑制剂calpeptin在机械通气膈肌损伤 和萎缩中的
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中华危重病急救医学2014年8月第26卷第8期ChinCritCareMed，August2014，Vol.26，No.8·论著·钙蛋白酶抑制剂calpeptin在机械通气膈肌损伤和萎缩中的作用研究
石磊郭虹黄佳茹马少林陈小平朱晓萍【摘要】目的探讨钙蛋白酶抑制剂calpeptin在机械通气所致膈肌损伤和膈肌萎缩中的作用。方法将24只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为麻醉对照组（CON组）、24h机械通气组（CMV组）、24h机械通气+钙蛋白酶抑制剂组（CMVC组）3组，每组8只。CON组仅腹腔麻醉大鼠，无机械通气和维持麻醉；CMV组行控制性机械通气24h；CMVC组在通气前2h和通气8、15、23h时分别皮下注射钙蛋白酶抑制剂calpeptin4mg/kg。术后观察各组大鼠膈肌超微结构、组织学改变及膈肌肌球蛋白重链（MHC）分型表达。结果①电镜下观察显示，CON组肌原纤维排列整体，线粒体形态正常。CMV组膈肌肌纤维排列紊乱，“Z线”消失，线粒体空泡变等；膈肌纤维损伤密度（×10-2/滋m2）显著高于CON组（36.8±13.7比6.4±6.3，t＝6.373，P＝0.001）。CMVC组
膈肌超微结构改变较CMV组明显改善；膈肌纤维损伤密度较CMV组明显降低（17.6±9.1比36.8±13.7，t＝
3.694，P＝0.002）。②光镜下观察显示，CON组膈肌肌纤维横截面形状规则，无病理改变。CMV组膈肌纤维横截
面不规则，内皮细胞肿胀，中央核出现。CMVC组病理改变较CMV组明显减轻。③CMV组大鼠膈肌MHC慢肌（MHCslow）和快肌（MHCfast）蛋白条带均较CON组变浅，蛋白条带灰度值分别降低了61.1%（t＝8.138，P＝
0.001）和77.1%（t＝8.844，P＝0.001），以MHCfast降低更为显著。CMVC组MHCslow和MHCfast蛋白条带灰度
值较CMV组分别升高了1.51倍（t＝4.601，P＝0.010）和1.33倍（t＝2.859，P＝0.011），以MHCslow升高更为显
著。结论24h机械通气可造成膈肌肌纤维损伤和肌萎缩，而钙蛋白酶抑制剂能明显逆转上述改变，提示钙蛋白酶在机械通气所致膈肌功能障碍中发挥了促进作用。【关键词】机械通气；膈肌；钙蛋白酶；肌损伤；肌萎缩
TheeffectofcalpeptinoninjuryandatrophyofdiaphragmundermechanicalventilationinratsShiLei*，GuoHong，HuangJiaru，MaShaolin，ChenXiaoping，ZhuXiaoping.*DepartmentofRespiratoryDiseases，ShanghaiEastHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200120，ChinaCorrespondingauthor：ZhuXiaoping，Email：z_xping@hotmail.com【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofcalpeptinondiaphragmaticinjuryandatrophyundercontrolledmechanicalventilationinrats.MethodsAtotalof24SPFSprague-Dawley（SD）ratswererandomlydividedintoanesthetizedcontrolgroup（CONgroup），24-hourcontrolledmechanicalventilationgroup（CMVgroup），and24-hourCMV+treatmentwithcalpeptingroup（CMVCgroup），with8ratsineachgroup.AnimalsintheCONgroupreceivedanintraperitonealinjectionofpentobarbitalsodiumwithoutCMVandcontinuousinfusionofpentobarbitalsodium.Asmall-animalventilatorwasusedfor24hoursinratsofCMVgroup.RatsofCMVCweretreatedwithaspecificcalpaininhibitorcalpeptin（4mg/kg）.Thedrugwasinjectedsubcutaneously2hoursbeforeand8，15and23hoursaftermechanicalventilation.Changesindiaphragmultrastructure，lightmicroscopicpicture，andmyosinheavychain（MHC）expressionwereobserved.Results①AlignmentofmyofilamentsandnormalZ-band，andtheshapeofmitochondriaweremaintainedinCONgroupasrevealedbyelectronmicroscope.Thesignsofmisalignmentofmyofibrils，disruptionofZ-bandandvacuolarmitochondriawerefoundinCMVgroup，andtheywereobviouslyimprovedinCMVCgroup.Thedensityofmuscleinjury（×10-2/滋m2）inCMVgroupwassignificantlyhigherthanthatincontrolgroup
（36.8±13.7vs.6.4±6.3，t＝6.373，P＝0.001），andthatinCMVCgroupwassignificantlylowered（17.6±9.1vs.
36.8±13.7，t＝3.694，P＝0.002）.②InCONgroup，thediaphragmfibersappearedregularincrosssectionwithout
pathologicchangeunderlightmicroscopy.Fuzzymusclestriations，irregularmusclefibers，centralizednucleiandswellingofcapillaryendothelialcellswereobservedinCMVgroup，whilepathologicalchangesintheCMVCgroupweremildersignificantly.③InCMVgroup，thedensityofMHCslowandMHCfastwaslowercomparedwiththatofCONgroup，andthegrayvaluewasloweredby61.1%（t＝8.138，P＝0.001）and77.1%（t＝8.844，P＝0.001），
respectively，especiallyinMHCfast.However，thegrayvaluesofMHCslowandMHCfastwereincreasedby1.51folds（t＝4.601，P＝0.010），and1.33folds（t＝2.859，P＝0.011），respectively，aftertreatmentwithcalpeptin，andthe
DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2014.08.005基金项目：国家自然科学基金（81170074）作者单位：200120上海，同济大学附属东方医院呼吸科（石磊、朱晓萍），ICU（马少林）；213003江苏，南京医科大学附属常州市第二人民医院（石磊）；750004银川，宁夏医科大学研究生院（郭虹、黄佳茹）；200092上海，同济大学医学院免疫教研室（陈小平）通信作者：朱晓萍，Email：z_xping@hotmail.com
549··中华危重病急救医学2014年8月第26卷第8期ChinCritCareMed，August2014，Vol.26，No.8机械通气是治疗急、慢性重症呼吸衰竭患者的必要手段［1］。但膈肌活动缺如、无负荷承受等可导致呼吸机相关的膈肌功能障碍（VIDD）［2］，如控制性机械通气12h即可出现膈肌收缩力下降并随通气时间延长而加重［3］。且VIDD与撤机困难密切相关，研究表明10例机械通气（78.4±42.8）d且难以撤机的呼吸衰竭患者，经吸气肌锻炼跨膈压提高后9例患者成功脱机［4］；在重症监护病房（ICU），约30%的机械通气患者存在脱机困难［5］。因此，探讨VIDD的机制对救治临床危重症机械通气患者具有重大的临床意义。钙蛋白酶（calpain）是一族钙离子依赖性的、水解半胱氨酸的蛋白酶，在肌细胞内“Z线”中浓度最高，其主要作用是降解细胞骨架蛋白和蛋白激酶等。钙蛋白酶可通过切割骨架蛋白协同ATP依赖的泛素蛋白酶体途径（UPP）降解肌纤维蛋白［6］。但它对骨架蛋白的起始拆分也伴随着肌损伤［7］。骨架蛋白能够维持肌纤维内相邻肌节于一体，以保证肌节三维结构的完整性。快速肌萎缩时，骨骼肌中钙蛋白酶活性是正常肌肉的数倍，呈现特征是“Z线”降解［6］。另外，膈肌萎缩也是导致VIDD的原因。在各种分解代谢状况下，80%～90%肌纤维蛋白通过UPP降解［6］。但UPP只能降解游离的肌动蛋白和肌球蛋白，肌纤维蛋白与肌节相连的骨架结构具有抵挡UPP降解收缩蛋白的作用。研究提示钙蛋白酶可能作用于UPP上游发挥协同作用［6］。calpeptin是一种可穿过细胞膜的钙蛋白酶抑制剂，能有效抑制钙蛋白酶主要活性组分钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2的活性［8］。因此，本研究假设钙蛋白酶在机械通气肌损伤和肌萎缩中发挥促进作用，观察特异性钙蛋白酶抑制剂calpeptin对VIDD的影响。1材料与方法1.1实验动物及分组处理：24只SPF级雄性SD大鼠，体质量320～410g，由上海中医药大学动物中心提供，许可证号：SYXK（沪）2009-0069。按计算机生成的随机数字表法将大鼠分为3组：麻醉对照组（CON组）、24h机械通气组（CMV组）、24h机械通气+钙蛋白酶抑制剂组（CMVC组），每组8只。1.1.1CON组：腹腔注射戊巴比妥钠60mg/kg麻醉大鼠，胸腹联合切开取膈肌。无机械通气和长时间的维持剂量麻醉。1.1.2CMV组：气管插管，接小动物呼吸机行控制性机械通气，呼吸频率80次/min，潮气量10mL/kg，吸气峰压12cmH2O（1cmH2O＝0.098kPa），呼气末正压（PEEP）1cmH2O。股静脉置管泵入2mL·kg-1·h-1
