乳酸菌中抑菌物质的分离方法

抑制芽孢杆菌乳酸菌的筛选鉴定及其抗菌物质的分离纯化赵圣明;曹雪珂;赵岩岩;马汉军;何鸿举【摘要】从朝鲜族辣白菜中分离筛选得到1株对芽孢杆菌具有广谱抑菌活性的菌株JLY-7,该菌株发酵液对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌等食品中常见的腐败性和致病性芽孢杆菌具有较强的抑制作用.对菌株JLY-7进行形态学特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析,鉴定其为植物乳杆菌.利用正丁醇萃取、凝胶过滤层析(Sephadex LH-20)和半制备液相色谱纯化等手段对该菌株所产抗菌物质进行分离纯化,得到单一活性抑菌组分,经高分辨电喷雾电离质谱确定该抗菌物质的分子量为694.129 Da.通过蛋白酶处理结果表明,该抗菌物质对常见的蛋白酶均非常敏感.本研究可为乳酸菌抗菌物质控制食品中芽孢杆菌奠定理论基础.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)011【总页数】8页(P144-150,165)【关键词】植物乳杆菌;抗菌物质;菌株鉴定;分离;纯化【作者】赵圣明;曹雪珂;赵岩岩;马汉军;何鸿举【作者单位】河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003;河南科技学院食品学院,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】TS252.54芽孢杆菌属是存在于乳制品、罐装食品、肉制品和面制品中的一类常见细菌,常引起食品腐败甚至是食源性疾病的发生[1-5]。

因其产生的芽孢具有高度的抗逆性,在巴氏杀菌条件下不能够完全被杀死,当环境适宜时,芽孢重新萌发,微生物迅速繁殖,因此引起包装食品腐败变质的微生物主要是芽孢杆菌属。

研究表明枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等能够引起年糕的粘液化[6];嗜热脂肪地芽孢杆菌存在于蔬菜及肉类罐头中导致平酸败坏[7,8];凝结芽孢杆菌导致桶装番茄酱胀罐等[9]。

1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。

2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。

调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。

改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。

10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。

挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。

稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。

45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。

乳酸菌的分离与筛选具体实验流程1. 引言1.1 背景介绍乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们能够以乳酸为代谢产物进行无氧发酵，并且在食品工业、农业和医学领域具有重要的应用价值。

乳酸菌不仅能够促进食品品质的改善和保鲜，还对人体健康具有积极影响。

然而，目前市面上存在许多商业化的乳酸菌制剂，其有效成分及效果并不尽相同。

因此，研究和筛选出优质活性的乳酸菌种类，具有重要意义和广阔前景。

1.2 研究意义本研究旨在通过分离与筛选方法得到高活性的乳酸菌。

通过该研究可以加深我们对乳酸菌及其作用机制的理解，并为特定领域如食品工业、农业等提供先进的技术支持和解决方案。

此外，筛选出具有优良特性的乳酸菌株也将为开发新型功能性食品、生物农药等领域的产品提供重要支持。

因此，本研究对于推动食品工业、农业发展具有积极意义。

1.3 实验目的本实验主要目的如下：- 收集和处理样品：收集富含乳酸菌的样品，并经过适当处理以提高分离效果。

- 选择与制备分离培养基：根据乳酸菌的特性选择适合的培养基并进行制备。

- 设定分离培养条件：通过调控温度、pH值等参数，确定适宜的乳酸菌分离培养条件。

- 鉴定活性乳酸菌指标：确定评价乳酸菌活性和质量的指标，并进行相关试验和检测。

- 设计与实施筛选试验：根据所选指标设计筛选试验，并在实验中采用相应方法进行实施。

- 可行性评估与结果分析：对筛选试验结果进行评估和分析，并总结可行性及相关优化建议。

通过以上实验流程，我们旨在深入了解乳酸菌的特点及其在不同领域中应用潜力，并为进一步研究和开发具有市场竞争力的乳酸菌产品提供理论和实践基础。

2. 乳酸菌的分离方法2.1 样品收集与处理在乳酸菌的分离研究中，样品的选择和处理十分重要。

我们可以选择不同来源的样品，如发酵食品、生态环境等。

收集样品后，需要进行适当的处理以消除非目标微生物对于乳酸菌生长和筛选的干扰。

常见的样品处理方法包括冷藏、过滤、稀释等。

2.2 分离培养基选择与制备为了促进乳酸菌的分离和生长，在实验中需要选择适宜的分离培养基。

《益生性乳酸菌的分离筛选及拮抗沙门氏菌感染功能的研究》篇一一、引言随着人们对健康饮食的日益关注，益生菌的保健作用受到了广泛关注。

其中，益生性乳酸菌因其对宿主健康的多种益处，已成为研究的热点。

本研究旨在分离筛选具有特定功能的益生性乳酸菌，并探讨其拮抗沙门氏菌感染的功能。

这将对开发新型益生菌产品、提高食品安全性具有重要意义。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料主要包括：各种发酵食品样品、培养基、沙门氏菌等。

2. 方法（1）乳酸菌的分离与筛选从各种发酵食品样品中分离出乳酸菌，通过形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，筛选出具有益生特性的乳酸菌。

（2）拮抗沙门氏菌试验采用体外试验方法，将筛选出的乳酸菌与沙门氏菌共同培养，观察乳酸菌对沙门氏菌生长的抑制作用。

（3）功能分析通过基因测序、PCR扩增等分子生物学技术，分析乳酸菌的拮抗机制及功能特点。

三、结果与讨论1. 乳酸菌的分离与筛选结果经过多次试验，我们从不同发酵食品中成功分离出多种乳酸菌。

经过形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，最终筛选出具有益生特性的乳酸菌。

这些乳酸菌在生长过程中能产生大量乳酸，具有良好的耐酸、耐胆盐等特性。

2. 拮抗沙门氏菌试验结果在体外试验中，我们发现筛选出的乳酸菌对沙门氏菌的生长具有明显的抑制作用。

通过观察共培养过程中的生长曲线，发现乳酸菌在生长过程中能产生某种物质，有效抑制沙门氏菌的生长。

这表明乳酸菌具有拮抗沙门氏菌的功能。

3. 功能分析结果通过基因测序、PCR扩增等分子生物学技术，我们分析了乳酸菌的拮抗机制及功能特点。

结果表明，乳酸菌通过产生某种抗菌物质、竞争营养、降低环境pH值等方式，有效抑制沙门氏菌的生长。

这为开发新型益生菌产品、提高食品安全性提供了重要的理论依据。

四、结论本研究成功地从不同发酵食品中分离筛选出具有益生特性的乳酸菌，并发现这些乳酸菌具有拮抗沙门氏菌的功能。

这为开发新型益生菌产品、提高食品安全性提供了重要的理论依据和实际指导。

乳酸细菌分离鉴定实验方法1. 引言乳酸细菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，具有产酸、发酵等特性。

它们在食品行业、农业、医药等领域起着重要作用。

乳酸细菌的分离和鉴定是开展与其相关研究的前提，本文将介绍乳酸细菌分离鉴定的实验方法。

2. 实验材料•乳酸发酵样本（如发酵米饭、酸奶等）•培养基（如MRS培养基）•罗丹明B染色液•麦芽糊精琼脂培养基3. 实验步骤3.1 分离乳酸细菌1.将乳酸发酵样本取1 mL加入10 mL生理盐水中，并进行搅拌均匀。

2.连续稀释梯度：取1 mL悬浮液加入9 mL生理盐水中，得到10-1的稀释液。

重复以上步骤，分别得到10-2、10-3、10-4的稀释液。

3.取少量10^-3的稀释液在无菌工作台上平均涂布于MRS培养基上。

4.使用无菌的三角铁将MRS培养基表面的细菌均匀划开，使得每个细菌分离单元上只有一种细菌。

5.将培养皿倒置放入恒温培养箱中，在37摄氏度下静置24至48小时。

3.2 鉴定乳酸细菌1.观察培养基上的菌落情况，通过形态特征初步判断乳酸细菌。

2.选择培养良好的单独菌落，采用罗丹明B染色法进行初步鉴定。

–取适量的培养菌落，加入1滴罗丹明B染色液，静置5分钟。

–在显微镜下观察染色后的细菌形态，乳酸细菌通常为革兰氏阳性菌（呈现红色染色）。

3.选择阳性菌落上悬浮液进行传代培养。

–取适量的菌落悬浮液，加入新的MRS培养基中，静置24至48小时。

4.进行进一步的鉴定。

–利用麦芽糊精琼脂培养基，通过观察菌落特征鉴定乳酸细菌的种类。

4. 结果分析与讨论通过上述方法，我们可以成功地分离和鉴定乳酸细菌。

乳酸细菌的分离是通过连续稀释梯度和培养基平板法实现的。

鉴定乳酸细菌主要基于其形态特征和罗丹明B染色结果。

进一步通过传代培养和麦芽糊精琼脂培养基来鉴定乳酸细菌的种类。

然而，需要注意的是，乳酸细菌有多个物种，每个物种的生理特性可能有所不同。

因此，在进行鉴定时应结合其他实验方法，如生理生化测试、基因测序等，以进一步明确鉴定结果。

乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的：1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。

明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。

通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。

酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。

细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

乳酸菌菌种的分离筛选方法WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

溶钙圈法分离乳酸菌第一篇嘿，亲爱的小伙伴们！今天咱们来聊聊溶钙圈法分离乳酸菌这个超有趣的事儿！你知道吗？乳酸菌可是个宝呢！它们能帮我们做出美味的酸奶，对咱们的肠道健康也有大大的好处。

那怎么把它们从一堆东西里找出来呢？这就得靠溶钙圈法啦！先准备好含有碳酸钙的培养基，就好像给乳酸菌们准备了一个特别的舞台。

然后把可能有乳酸菌的样品涂在上面。

这时候，神奇的事情就发生啦！乳酸菌会产生酸性物质，和碳酸钙发生反应。

那些产生酸性物质厉害的乳酸菌周围，就会出现一个个明显的溶钙圈。

就好像它们给自己画了个小圈圈，说：“看，我在这儿呢！”这个过程就像在玩一个找宝藏的游戏，溶钙圈就是宝藏的线索。

找到这些有溶钙圈的地方，我们就能把可爱的乳酸菌宝宝们分离出来啦！怎么样，是不是觉得超级有趣？下次有机会，咱们也可以自己动手试试哦！第二篇哈喽呀！今天咱们来好好说一说溶钙圈法分离乳酸菌哟！想象一下，乳酸菌就像一群藏在草丛里的小精灵，而溶钙圈法就是我们找到它们的魔法棒。

呢，得把培养基准备好，这个培养基里加了碳酸钙，就像是给乳酸菌们设下的小陷阱。

然后把样品轻轻涂上去，就等着乳酸菌们露出马脚啦。

乳酸菌在生长的时候会产生酸，这些酸一碰到碳酸钙，就像是两个冤家碰头，立马就起反应。

于是乎，在乳酸菌的周围，就会形成一圈空白，这就是溶钙圈啦！你看，这溶钙圈就像是乳酸菌给自己做的标记，告诉我们：“快来找我呀！”我们只要顺着这些标记，就能把它们一个一个地揪出来。

用溶钙圈法分离乳酸菌，感觉就像是一场小小的科学探险，充满了惊喜和乐趣。

说不定通过这个方法，我们还能发现一些超级厉害的乳酸菌，为我们的生活带来更多的美好呢！怎么样，是不是对溶钙圈法分离乳酸菌有了新的认识？。

食品中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌是一类重要的微生物，在食品加工和保质过程中起着关键作用。

乳酸菌具有产生乳酸的能力，能够抑制有害菌的生长，提高食品的质量和安全性。

因此，乳酸菌的分离与鉴定对于食品工业具有重要意义。

乳酸菌的分离方法多种多样，常用的有直接涂布法、稀释涂布法和差减分离法等。

其中，直接涂布法是最常用的方法之一。

直接涂布法是将食品样品均匀涂布于含有特定培养基的琼脂平板上，利用乳酸菌对特定培养基的选择性生长来分离乳酸菌。

稀释涂布法则是将食品样品稀释到一定程度后，涂布于琼脂平板上进行分离。

差减分离法是相对于稀释涂布法的一种改进方法，通过两个不同培养基的对比，进一步筛选出乳酸菌。

乳酸菌的鉴定方法主要包括形态学观察、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学观察是最基本的鉴定手段之一，通过显微镜观察菌落和细胞形态特征，可以初步判断出乳酸菌的种类。

生理生化特性鉴定是将分离出的菌株在不同条件下进行相关实验，如气体产生、温度耐受性、胞外酶产生等，通过对比不同特性的表现，进一步鉴定乳酸菌的种类。

而分子生物学鉴定则能够更准确地确定乳酸菌的种属和亚属，如通过PCR扩增特定基因序列，利用DNA测序技术进行序列比对，从而鉴定乳酸菌的种类。

乳酸菌的分离与鉴定在实际食品加工中具有重要意义。

首先，通过分离和鉴定乳酸菌，可以确定食品中乳酸菌的种类和数量，进而判断食品是否存在质量和安全性问题。

其次，乳酸菌的鉴定有助于选择合适的培养条件，促进乳酸菌的生长和产酸过程，从而提高食品品质。

此外，乳酸菌的鉴定也有利于乳品行业中的产品研发和工艺改进，为创新和提高乳制品的营养和口感贡献力量。

然而，乳酸菌的分离与鉴定也面临一些挑战。

首先，食品中的乳酸菌种类繁多，分离出纯种菌株的难度较大。

其次，乳酸菌的生理生化特性相似，需要较为精确的实验手段和技术设备来进行鉴定。

此外，乳酸菌与其他微生物的相互作用也需要考虑，有时候必须结合其他鉴定方法才能得出准确结论。

乳酸菌产苯乳酸及分离提取的研究
乳酸菌产苯乳酸及其分离提取的研究，是对乳酸菌及其代谢产物苯乳酸进行研究和应用的领域。

乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，常见于发酵食品中，例如酸奶和乳酸发酵蔬菜。

乳酸菌通过对碳水化合物的发酵代谢产生乳酸和其他有机酸，其中包括苯乳酸（phenyllactic acid）。

苯乳酸是一种具有抗菌活性的有机酸，具有广泛的应用潜力。

研究表明苯乳酸对抗多种致病菌具有很强的抑制作用，包括肠道致病菌和食品中的腐败菌。

因此，通过乳酸菌发酵产生苯乳酸，可以用于食品保鲜、食品安全等方面。

乳酸菌产苯乳酸的研究，在实验室中可以通过培养乳酸菌，并结合相关的培养基和条件，来促进苯乳酸的产生。

研究人员可以通过监测培养液中的苯乳酸含量，来评估不同因素对苯乳酸产量的影响，例如培养基成分、培养条件（温度、pH值、培
养时间等）等。

苯乳酸的提取通常采用化学提取的方法，可以通过酸碱法、溶剂萃取或其他特定提取方法来获得纯度较高的苯乳酸。

提取后的苯乳酸可以进行进一步的纯化和分析，以获取更多的相关性质和应用信息。

通过乳酸菌产苯乳酸及分离提取的研究，可以为苯乳酸的应用
提供科学依据，并为开发乳酸菌发酵产物的新型食品添加剂或药物提供技术支持。

牦牛乳酸菌的分离与鉴定研究牦牛乳酸菌是一类生长在牦牛乳制品中的微生物，它们能够发酵乳制品并产生乳酸。

对于牦牛乳酸菌的分离与鉴定研究，是为了探索其在乳制品加工过程中的作用、发酵特性、功能以及潜在的应用价值。

本文将从牦牛乳酸菌的分离、鉴定方法和研究进展方面进行探讨。

一、牦牛乳酸菌的分离牦牛乳酸菌的分离是研究的第一步，通过分离可以获取到原始的菌株，为后续的鉴定和研究提供基础。

常用的分离方法包括表面划线法、稀释法和厌氧法等。

具体操作步骤如下：1. 表面划线法：将牦牛乳制品样品均匀涂布在适宜的固体培养基上，使用无菌的匀涂棒划线，然后在适当的温度下进行培养。

待菌落出现后，用无菌环针进行遴选，然后重新培养以确保单菌落数量。

2. 稀释法：将牦牛乳样品适当稀释，然后将稀释液均匀涂布在固体培养基上，培养后进行挑选和筛选。

3. 厌氧法：对于一些需要在厌氧条件下生长的乳酸菌，可以采用厌氧培养法进行分离。

将样品接种到含有适宜酸碱指示剂的厌氧培养基中，通过颜色变化来判断是否有乳酸菌生长。

二、牦牛乳酸菌的鉴定鉴定牦牛乳酸菌的目的是确定其分类地位和种属。

鉴定可以使用多种方法，包括形态学观察、生理生化特性分析和分子生物学方法。

具体措施如下：1. 形态学观察：观察牦牛乳酸菌的形态特征，包括菌落形态、菌体形态、气泡形成和芽孢形成等。

2. 生理生化特性分析：通过检测牦牛乳酸菌的生理生化特性，如产酸能力、气体产生、温度和pH值耐受性等。

常用的方法包括酶活性测定、糖利用能力测试和抗生素敏感性试验等。

3. 分子生物学方法：利用分子生物学方法可以更准确地鉴定牦牛乳酸菌的分类地位和种属信息。

例如，可以使用16S rRNA基因序列分析、PCR扩增和限制酶切以及序列分析等。

三、牦牛乳酸菌的研究进展近年来，对牦牛乳酸菌的研究取得了一些重要进展。

以下是几个研究方向的简要介绍：1. 发酵特性：研究人员对牦牛乳酸菌的发酵特性进行了深入研究，包括产乳酸速率、产物种类和酸度调节等方面。

乳酸菌的简介乳酸菌的简介⼀、乳酸菌的起源根据圣经旧的书上记载，公元前4000多年，⼈类已经开始发酵乳酸⾁制品及蔬菜腌渍物。

直到公元1857年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微⼩⽣物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微⽣物作⽤所致的秘密才⾸次得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。

1873年李斯特(Lister)利⽤稀释法，由酸乳中纯化分离出Bacterium lactis，也就是⽬前的Lactococcus lactis，这是乳酸菌最早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。

⼆、乳酸菌的定义乳酸菌⼀般是指能将碳⽔化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐⽊隆,1998)。

乳酸菌群具有以下⼏点特性：1.为⾰兰⽒阳性(gram positive)球菌或杆菌。

2.不产⽣孢⼦(nonsporting)且⽆运动性(nonmotile)3.不具分泌催化酶(catalase negative)之能⼒。

4.可在有氧环境⽣长，但以⽆氧状态下⽣存较佳，亦有绝对厌氧者。

5.需有碳⽔化合物、胺基酸、维⽣素等多种⽣长因⼦⽅能⽣长之复合营养需求性(complex nutritional requirements)。

6.依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发酵(heterofermentative)两种乳酸菌。

同质发酵性乳酸菌含有aldolase，最终产物90％-100％为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有phosphoketolase，其最终产物除了40％-50％的乳酸外，还包括⼄醇、⼆氧化碳及醋酸等多项产物(Ingledew,1995)。

乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有利于⽣存的条件，故消化道三⼤菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997)三、乳酸菌的分类乳酸菌⼀般包括Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及Pediococcus (Ped.)四属；⼴义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。

蒙牛达能乳酸菌分离，鉴定实验流程1 乳酸菌的分离纯化采用BCG牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。

以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5各0.1mL置于灭菌后的平板中,加入15mL BCG牛乳培养基,带培养基凝固后放入恒温培养箱中,37℃恒温培养24h。

观察结果稍扁平的黄色菌落,周围培养基变为黄色,初步定为乳酸菌。

2 菌种的扩大培养配制MRS液体培养基,分装到试管中(每管约15mL),将选出的菌种接种到试管中在37℃条件下扩大培养24h,在接种到小三角瓶中扩大培养24h。

3乳酸菌的鉴定(1)形态学观察。

挑选出产抑菌物质的菌株,在合适的培养基上划线培养24h,待长出单菌落观察其菌落特征,在光学显微镜下观察其观察菌体形状、排列方式、有无芽孢等个体形态特征。

(2)生理实验。

①经固体培养基分离和液体培养基扩大培养的嗜热链球菌接种于脱脂乳中,在不同温度下培养发酵,结果嗜热链球菌在40℃左右时约需3h凝乳;在45℃以上,随着温度提高,凝乳时间延长;当培养温度大于55℃时,没有凝乳发生。

当培养温度低于40℃时,随着培养温度的降低,凝乳时间延长;当温底低于25℃时,不能凝乳。

②将普通滤纸剪成约0.5cm～0.6cm宽的纸条,长度根据试管和培养基高度而定。

用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透,然后置于烘干,放入培养皿或试管内,灭菌后备用。

将新鲜试验菌培养物接种于培养液后,用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。

下端接近培养基表面而不接触液面,上端用棉塞塞紧。

试验中设空白对照,在未接种的试管培养上悬挂乙酸铅纸条。

另外接种已知菌的阴性反应作对照。

置于37℃培养培养1d～3d,进行观察比较,纸条变黑为阳性反应。

(3)乳酸菌的保藏将具有较强抑菌活性的乳酸菌活化培养,并加入一定的保护剂,在-76℃及真空下冻干3d后,放-20℃冰箱贮藏。

4 结果与分析（1）乳酸菌的鉴定（2）形态学观察(表1)（3）生理特征鉴定根据生理生化实验结果,经过删选比对,菌株GL5的生理生化特性与干酪乳杆菌最相似。

乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌的分离鉴定主要包括以下步骤：
1. 菌落筛选：根据菌落的颜色、大小、光泽度和透明程度，挑取含溶钙圈的单菌落。

2. 分离纯化：在MRS或Elliker固体培养基上反复划线分离，直到分离到纯的单一菌落。

3. 革兰氏染色：镜检观察菌体颜色、大小、形状和排列方式。

4. 过氧化氢酶实验：将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌。

5. 保藏：用终浓度为25%甘油冻存管进行菌株的保藏，置于-80℃冰箱中保存备用。

乳酸菌的试验方法主要包括以下步骤：
1. 耐酸性优良菌株筛选试验：将分离纯化的乳酸菌和实验室耐酸性较好的WHH544接种到MRS液体培养基中，接种量为2%，于37℃培养箱中培养24小时，连续活化2代后，以6000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀菌体用灭菌生理盐水洗涤、离心2次后，通过麦氏比浊法调整菌悬液浓度为×108CFU/mL。

2. 其他试验：根据具体研究需求进行相关试验，例如通过不同条件培养，观察菌株生长情况；或通过发酵实验，测定乳酸菌的产酸能力等。

以上内容仅供参考，建议查阅专业微生物学书籍或文献获取更全面和准确的信息。