8乳酸菌的分离培养纯化学习资料

乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。

明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。

通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。

酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。

细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。

二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。

实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。

三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

大多数不运动，少数以周毛运动。

菌体常排列成链。

根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。

在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。

四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方蛋白胨 2.0g酵母膏 2.0g番茄汁40g葡萄糖 2.0g吐温0.10mL碳酸钙 3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。

②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。

依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。

③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。

④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。

⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。

3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。

用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。

然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。

乳酸菌的分离与纯化实验报告一、实验目的：1. 掌握乳酸菌的分离与纯化方法；2. 学习乳酸菌的形态特征及生长特性；3. 熟悉微生物实验室操作规范和安全注意事项。

二、实验原理：乳酸菌属于革兰氏阳性细菌，可以利用革兰染色方法进行初步鉴定。

乳酸菌的形态特征有很大差异，有的呈短杆状、短圆柱状，有的呈梭形或球形。

乳酸菌的培养基选择要根据实验目的而定，一般常用的是MRS培养基。

常规乳酸菌分离方法有两种：血漂白法和渐进稀释法。

血漂白法是用过氧化氢或次氯酸钠等对血液进行漂白处理后加入培养基进行分离，由于血液中含有多种抑菌物质，故需漂白处理后方能使用。

渐进稀释法则是将混菌液逐步稀释后按一定比例接种于选定的培养基上，经过多次传代，可得到单一的菌落。

三、实验步骤：1. 取适量样品加入1ml生理盐水中，充分摇匀。

2. 再从上述稀释液中取出1ml加入9ml生理盐水中，得到10-2悬液。

3. 再抽取1ml悬液加入9ml生理盐水中，得到10-3悬液。

4. 分别取适量的10-2和10-3悬液接种于MRS培养基上，并分别转移多次，培养时间一般为24-48小时，必要时可延长到72小时。

5. 分离菌落后进行鉴定。

四、结果及分析：实验结果显示，经过分离培养，从10-2和10-3悬液中分别分离出了多个菌落，经过重复转移，逐步稀释，最终获得了单一的菌落，可见分离培养方法的有效性和行之有效的可行性。

鉴定乳酸菌的一般方法包括形态学鉴定、生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学鉴定包括形态、大小、形状和染色等方面；生化特性鉴定则主要包括代谢途径、酸产生量和果糖发酵能力等；分子生物学鉴定则是通过特异性引物扩增菌株中的核酸，进行分子水平鉴定。

五、实验心得：本次实验通过乳酸菌分离、培养和鉴定的过程，使我对乳酸菌的形态特征、生长特性和鉴定方法有了更深入的了解。

同时，要时刻注意实验室的操作规范和安全问题，确保实验顺利进行。

在今后的实验中，我将更加重视实验操作的规范性和安全性。

乳酸菌的分离纯化乳酸菌的分离与纯化1.实验目的2.实验材料2.1试验设备天平、牛角匙、电炉、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、试管、棉塞、培养基、吸管、牛皮纸、线绳、标签、500mL锥形瓶两个、250mL锥形瓶两个、试管20只、500mL烧杯两个、250mL烧杯两个、100mL 烧杯两个、酒精灯、石棉网、接种针（环）。

2.2实验仪器50L的高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超镜台、光学显微镜、75%酒精棉、冰箱。

2.3实验药品新鲜酸奶、脱脂奶粉或全脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液、酵母膏、琼脂、结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、诗坛酸复红染液。

3.试验方法及操作过程3.1BCG牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80℃灭菌20min。

（B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121℃灭菌2.min。

按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。

琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。

在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。

3.2倒BCG培养基平板的方法将灭好菌的A液和B液趁热充分混合，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面，等培养基冷却凝固后倒放并贴上标签。

（注意：整个实验要在酒精灯附近做，以保证培养基不染菌）3.3脱脂乳试管的配制与灭菌直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的范围内）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。

1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。

2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。

调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。

改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。

10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。

挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。

稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。

45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。

乳酸菌的分离培养保加利亚乳杆菌组长：组员：实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术；3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。

4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。

5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。

6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。

明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。

7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。

实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。

通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。

酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。

细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分:乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g;2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤:1、培养基配制(BCG牛乳培养基):(A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成)(B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

2、药品配制2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。

将两液混匀,放置24小时后过滤即可。

2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。

2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。

实验十一酸奶中乳酸菌的分离纯化一、实验目的学习从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化的方法，并进一步了解乳酸菌的生长特性。

二、实验材料和用具嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus casei），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。

BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基（CMRS）、脱脂乳粉、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200 - 280mL）、培养皿、试管、300mL三角瓶。

三、操作步骤1.分离：取市售新鲜酸乳液稀释至10-5，取其中的10-4 10-5 2个稀释度的稀释液各0.1-0. 2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接灌注法分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

2.鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。

四、注意事项采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。

BCG牛乳培养基（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。

乳酸菌培养基（CMRS）蛋白胨5g；牛肉膏 5 g ；酵母浸膏 2.5 g ；乳糖7.5 g；土温80 0.5ml；磷酸氢二钾1g ；乙酸钠 2.5g ；柠檬酸二铵1g ；七水硫酸镁0.1g ；四水硫酸锰0.1g ；番茄汁50ml；琼脂条9g；加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为6.8，115℃，灭菌15分钟。

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH 试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤：1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

2.药品配制2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。

将两液混匀，放置24小时后过滤即可。

2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。

2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分：乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤：1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

2.药品配制2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。

将两液混匀，放置24小时后过滤即可。

2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。

2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取20ml 与80ml蒸馏水混匀即可。

2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。