乳酸菌的分离纯化说课讲解

LUOYANG NORMAL UNIVERSITY2015届毕业论文乳酸菌的分离纯化及抑菌实验院（系）名称生命科学学院专业名称生物技术学生姓名勾倩倩学号111344045指导老师易力副教授完成时间2015年5月7日乳酸菌的分离纯化及抑菌实验勾倩倩生命科学学院生物技术专业学号：111344045指导教师：易立副教授摘要：本文对乳酸菌的分离纯化，革兰氏染色以及抑菌实验进行阐述，从市售酸菜中分离纯化得到乳酸菌，革兰氏染色进行鉴定，最后进行金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌实验！实验主要是分离纯化，革兰氏染色，最后用抑菌实验比较单菌株的抑菌能力。

关键词：乳酸菌：分离纯化；革兰氏染色；抑菌乳酸菌 (LA B ，Lactic acid bacteria)是指能使碳水化合物(主要为葡萄糖)发酵产生大量乳酸的细菌的通称，这类细菌生长在矿物质和有机营养丰富的微酸性环境中[1,2]。

在自然界中比较常见，用途广泛，它可以改善食物的风味，并延长食品的货架期，作为保健食品和药品，可以改善和提高人的健康水平，延年益寿，还可以作为微生物学和微生态学领域研究的模式生物[3]。

酸菜是世界性大众化蔬菜腌制品,在我国历史悠久[4]，其自然发酵的主要菌群是乳酸菌[5]。

人体在摄人发酵酸菜时，也同时摄入了大量的乳酸菌体及其代谢产物[6]。

乳酸菌是酸菜发酵过程中的有益菌，在发酵速度以及发酵产品品质等方面都起到至关重要的作用。

因此在微生物学和食品科学的研究中，对酸菜中乳酸菌进行鉴定是必要的[7]。

本实验从酸菜中分离纯化得到6株乳酸菌（1,2,3,4,5,6），进行革兰氏染色，为紫色杆状，最后进行抑菌实验，比较6株乳酸菌的抑菌能力。

1 材料与仪器1.1 菌种乳酸菌1.2 样品来源市售新鲜酸菜1.3 培养基（1）乳酸菌分离培养基（固体MRS培养基）：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸铵1g，乙酸钠2.5g，硫酸镁0.29g，硫酸锰0.125g，吐温80 0.5 mL，琼脂8.5g，蒸馏水500mL，pH7.0（2）乳酸菌纯化培养基：MRS培养基+1%的碳酸钙溶液（碳酸钙1g，蒸馏水100mL）（3）乳酸菌富集培养培养基（液体MRS培养基）：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，牛肉膏5g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1g，柠檬酸铵1g，乙酸钠2.5g，硫酸镁0.29g，硫酸锰0.125g，吐温80 0.5 mL，蒸馏水500mL，pH7.0（4）抑菌实验培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，琼脂粉7.5g，水500mL，pH7.21.4 仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，锥形瓶，移液枪，涂布棒，接种针2 方法与过程2.1 酸菜中菌种的分离培养（平板涂布法）吸取汤汁0.1ml，加入9ml无菌水中进行100倍稀释，依次做5个梯度，每个梯度分别取0.2ml涂布于灭好菌MRS培养基中，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，然后用封口膜封住培养皿，平放于试验台上20 min，然后倒置于37℃恒温箱中培养48h。

乳酸菌的分离与纯化实验报告一、实验目的：1. 掌握乳酸菌的分离与纯化方法；2. 学习乳酸菌的形态特征及生长特性；3. 熟悉微生物实验室操作规范和安全注意事项。

二、实验原理：乳酸菌属于革兰氏阳性细菌，可以利用革兰染色方法进行初步鉴定。

乳酸菌的形态特征有很大差异，有的呈短杆状、短圆柱状，有的呈梭形或球形。

乳酸菌的培养基选择要根据实验目的而定，一般常用的是MRS培养基。

常规乳酸菌分离方法有两种：血漂白法和渐进稀释法。

血漂白法是用过氧化氢或次氯酸钠等对血液进行漂白处理后加入培养基进行分离，由于血液中含有多种抑菌物质，故需漂白处理后方能使用。

渐进稀释法则是将混菌液逐步稀释后按一定比例接种于选定的培养基上，经过多次传代，可得到单一的菌落。

三、实验步骤：1. 取适量样品加入1ml生理盐水中，充分摇匀。

2. 再从上述稀释液中取出1ml加入9ml生理盐水中，得到10-2悬液。

3. 再抽取1ml悬液加入9ml生理盐水中，得到10-3悬液。

4. 分别取适量的10-2和10-3悬液接种于MRS培养基上，并分别转移多次，培养时间一般为24-48小时，必要时可延长到72小时。

5. 分离菌落后进行鉴定。

四、结果及分析：实验结果显示，经过分离培养，从10-2和10-3悬液中分别分离出了多个菌落，经过重复转移，逐步稀释，最终获得了单一的菌落，可见分离培养方法的有效性和行之有效的可行性。

鉴定乳酸菌的一般方法包括形态学鉴定、生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学鉴定包括形态、大小、形状和染色等方面；生化特性鉴定则主要包括代谢途径、酸产生量和果糖发酵能力等；分子生物学鉴定则是通过特异性引物扩增菌株中的核酸，进行分子水平鉴定。

五、实验心得：本次实验通过乳酸菌分离、培养和鉴定的过程，使我对乳酸菌的形态特征、生长特性和鉴定方法有了更深入的了解。

同时，要时刻注意实验室的操作规范和安全问题，确保实验顺利进行。

在今后的实验中，我将更加重视实验操作的规范性和安全性。

乳酸菌的分别.纯化与判定第一部分：乳酸菌的分别.纯化一.实验器材:新颖乳酸饮料（市售）.脱脂奶粉.蔗糖.1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿.无水乙醇).酵母膏.琼脂.革兰氏染液（结晶紫染液.卢戈氏碘液.95%乙醇.沙黄）.75%乙醇.喷鼻柏油.1mol/LNaOH.1mol/L HCl.碳酸钙;0.4gNaOH固体.4.2ml浓HCL(剖析纯) .20gCaCO3固体.酵母膏20g .琼脂30g喷鼻柏油.脱脂奶粉100g .蔗糖10g;2.仪器与装备高压蒸汽灭菌锅.光学显微镜.造就箱.pH试纸.酸乳瓶.造就皿（φ9或φ12）.试管.300ml三角瓶（带玻珠）.移液管.天平.500ml锥形瓶.250ml锥形瓶.250ml烧杯.二.实验步调：1.造就基配制（BCG牛乳造就基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,参加1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混杂平均后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿参加20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热消融,用周详pH试纸调节pH到6.8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min.以无菌操纵趁热将(A)(B)溶液平均混杂.2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml,1%草酸氨水溶液80ml.将两液混匀,放置24小时后过滤即可.2.2 卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml.先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后参加碘使之完整消融,再参加蒸馏水300ml即成.2.3 蕃红溶液：番红2.5g,95%乙醇100ml,消融后存于密闭的棕色瓶中.用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可.2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g,95%乙醇300ml;B液：0.01% KOH 100ml.混杂A和B液即成,按1：100稀释即可. 2.4 心理盐水：称取9g氯化钠,消融在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升.取1干净三角瓶,盛以225ml心理盐水;7只干净试管,各盛9ml的心理盐水;加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min,得到无菌心理盐水.将酸奶样品搅拌平均,用无菌移液管汲取样品25ml参加盛有225ml无菌心理盐水的三角瓶中,在旋涡平均器上充分振摇,使样品平均疏散,即为10-1的样品稀释液;将7只装9ml心理盐水的无菌试管,依次标识表记标帜 10-2.10-3.10-4.10-5.10-6.10-7,再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中,稀释混匀便得到10-2稀释液,如斯反复依次制得10-3～10-7的稀释液.取无菌平板12个,编号标明10-1.10-5.10-6.10-7各三套;将经高温消毒的造就基冷却到50℃阁下,按无菌操纵法倒12只平板,每皿约15ml;平置使造就基平均散布在皿底,待凝固.A．平板划线接种环挑取10-1菌液,按无菌操纵对标有”10-1”的3个平板进行划操纵;划线完毕后,盖上皿盖,倒置放在40℃恒温造就箱中造就48小时.B．平板涂布用三支1ml无菌移液管分别汲取10-5.10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml,对号接种于与之对应的3个无菌平板中,每个平皿放0.1ml;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布平均,平放于实验台上20 Min;然后倒置于40℃恒温箱中造就48小时.直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克,水95克（蔗糖与水的比例在1：10的规模内）的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min.恒温造就48小时事后,掏出造就平板;选择菌落散布较好的平板,先对其菌落形态进行不雅察,初步找出乳酸菌菌落.乳酸菌的菌落很小,大约1~3 mm,园形隆起,概况滑腻或稍光滑,呈乳白色.灰白色或暗黄色;在产酸菌落四周还能产生CaCO3的消融圈.40℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基变成黄色者初步定为乳酸菌.拔取乳酸菌典范菌落转致脱脂乳试管中,40℃造就8~24h若牛乳消失凝固,无气泡,显酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色显阳性,则可将其持续传代3次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用.发酵：不雅察BCG造就基中乳酸菌菌落特点,拔取长势比较好的菌落无菌操纵下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中,40～42℃静止造就.取清洁载玻片一块,在载玻片中心加一滴心理盐水,无菌操纵法取少量菌体涂片;结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染,湿润后用油镜不雅察,菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌;个中保加利亚乳杆菌呈杆状,成单杆.双杆或长丝状;嗜热链球菌,呈球状,成对或短链或长链状. 革兰氏阳性,无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌,记载测定成果.第二部分：乳酸菌判定一.实验器材1.蛋白胨水造就基：蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4121 摄氏度湿热灭菌 20 min2.糖发酵造就基：蛋白胨水造就基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液（葡萄糖,蔗糖）各10 ml.3.有关试剂1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml乙醇中,贮存于棕色瓶中保管备用.吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml.10 % 硫酸,2 % 高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银消融后,掏出10 ml 备用,向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水,即可形成很厚的沉淀,持续滴加氨水至沉淀方才消融成为澄清溶液为止,再将备用的硝酸银慢慢滴入,则溶液消失薄雾,但轻轻动摇后,薄雾状的沉淀又消掉,持续滴入硝酸银,直到动摇后仍呈现稍微而稳固的薄雾状沉淀为止.二.判定实验采取牛肉膏蛋白胨造就基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下造就20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特点的不雅察.染色办法：涂片固定;草酸铵结晶紫染1分钟;自来水冲洗;加碘液笼罩涂面染约1分钟;水洗,用吸水纸吸去水分;加95%酒精数滴,并轻轻动摇进行脱色,20秒后水洗,吸去水分;蕃红染色液（稀）染2分钟后,自来水冲洗.湿润,镜检.2.发展前提实验(1)耐盐性实验(NaCl 浓度:0. 85 .1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱实验(p H :4. 3 .5. 7 .6. 8 .8. 4 .8. 6 和8. 7) ;(3)温度梯度实验(温度: 10℃.30℃.40℃.50℃.55℃.60℃和65℃) .分别将参试菌接种于以上处理的液体造就基中造就48 h ,记载发展状态.3.厌氧发展测定将菌种接入养分肉汤平板后,用密封带包好放入CO2造就箱37℃造就2天后,不雅察发展情形,发展则为阳性.含硝酸钾的养分肉汤参加2g硝酸钾入养分肉汤4.心理生化实验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY造就基斜面上,37℃造就20h—24h,取一环接种的造就物,涂于清洁的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反响,无气泡为阴性反响.蛋白胨.酵母膏.葡萄糖（PGY）造就基：蛋白胨10g,酵母膏5g ,葡萄糖1g,蒸馏水1L .(2)甲基红（M.R）实验接种实验细菌于PYG造就基,于37℃造就2天后,于造就物中参加几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,暗示阳性.(3)吲哚实验1）.试管标识表记标帜：取装有蛋白胨水造就基的试管2支,分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比.2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔到标识表记标帜乳酸菌的试管中,标识表记标帜有空白对比的不接种,置37摄氏度恒温箱中造就24~48小时.3）.不雅察记载：在造就基中参加乙醚1~2 ml ,经充分振荡,使吲哚萃取至乙醚中,静置少焉后乙醚层浮于造就液的上面,此时沿管壁迟缓参加5~10滴吲哚试剂,若有吲哚消失,乙醚层呈玫瑰色,此为吲哚实验阳性反响,不然为阴性反响.(4).糖发酵实验1）.试管标识表记标帜：取分别装有葡萄糖,蔗糖发酵造就液试管各2支,每种糖发酵试管平分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比. 2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔至以上各响应试管中,每种糖发酵造就液的空白对比均不接菌.将装有造就液的杜氏小管倒置试管中,置37摄氏度恒温造就箱中造就24小时,不雅察成果.3）.不雅察记载：与对比管比较,若接种造就液保持原由色彩,其反应成果为阴性;假如造就液呈黄色,反应成果为阳性.造就液中的杜氏小管内有气泡为阳性反响,杜氏小管内没有气泡为阴性反响.(5).乳酸的检测选用已经分别的菌种做小型发酵实验,取发酵液的上清液约10 ml于试管中,参加10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中,微火加热试管至沸,不雅察滤纸变更.（6）乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）接种新颖的实验菌种于造就基中, 37℃造就2天后,取葡萄糖蛋白胨造就液1mL在个中参加1ml 10％的NaOH,混匀,再参加3－4滴2%氯化铁溶液.数小时后,造就基概况的基层消失红色者,为阳性.（7）明胶液化实验将实验菌接种于明胶基本造就基中,置37℃造就,以一支未接种的试管作为对比.将接种的和未接种的对比管置于冰箱或冷水中,等待对比管凝固跋文录实验成果,反复不雅察比较多次.如对比管凝固时,接种管液化为阳性反响,凝固为阴性反响明胶造就基成分：NaCl 5g,蛋白胨10g,牛肉膏3g,明胶120g,蒸馏水1000mL.制法：在水浴锅中将上述成分熔解,不竭搅拌.熔解后调pH 7.2~7.4,121°C 灭菌30min.(8)石蕊牛奶的反响牛奶中重要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中参加石蕊是作为酸碱指导剂和氧化还原指导剂.石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白.不雅察其产酸.产碱.胨化.酸凝固.凝乳酶凝固.还原情形.。

1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。

2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。

调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。

改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。

10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。

挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。

稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。

45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。

乳酸菌的分离一、实验目的: (1)了解乳酸菌的菌落特征及细胞形态；(2)了解乳酸菌的分离及鉴定原理。

二、实验内容: 酸乳中乳酸菌的分离及初步鉴定(1)从酸乳中分离乳酸菌；(2)对乳酸菌进行初步鉴定。

三、实验器材:样品：含乳酸菌的酸奶；培养基：BCG牛乳培养基；设备：高压蒸汽灭菌锅，电磁炉，恒温培养箱；仪器用品：1000ml烧杯一个，500ml量筒一个, 无菌培养皿12个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。

药品：结晶紫，乙醇，草酸氨，碘，碘化钾，番红，番红，NaOH，NaCl。

三、实验原理:自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,用以培养,分离,鉴定,保存各种微生物和代谢产物。

此次分离纯化乳酸菌采用BCG牛乳培养基[3]。

乳酸菌分离目的是要在培养基上出现乳酸菌的单个菌落，为此我们采用以下两种方法：平板划线法：平板划线分离法是将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后繁殖成单菌落；从而得到待分离菌种的纯种。

其原理是将微生物在固体培养基表面多次做”由点到线”稀释而达到分离的目的。

平板涂布法：平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分:乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g;2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤:1、培养基配制(BCG牛乳培养基):(A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成)(B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

2、药品配制2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。

将两液混匀,放置24小时后过滤即可。

2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。

2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。