酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化PPT课件

乳酸菌的分别.纯化与判定第一部分：乳酸菌的分别.纯化一.实验器材:新颖乳酸饮料（市售）.脱脂奶粉.蔗糖.1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿.无水乙醇).酵母膏.琼脂.革兰氏染液（结晶紫染液.卢戈氏碘液.95%乙醇.沙黄）.75%乙醇.喷鼻柏油.1mol/LNaOH.1mol/L HCl.碳酸钙;0.4gNaOH固体.4.2ml浓HCL(剖析纯) .20gCaCO3固体.酵母膏20g .琼脂30g喷鼻柏油.脱脂奶粉100g .蔗糖10g;2.仪器与装备高压蒸汽灭菌锅.光学显微镜.造就箱.pH试纸.酸乳瓶.造就皿（φ9或φ12）.试管.300ml三角瓶（带玻珠）.移液管.天平.500ml锥形瓶.250ml锥形瓶.250ml烧杯.二.实验步调：1.造就基配制（BCG牛乳造就基）：（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,参加1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混杂平均后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿参加20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热消融,用周详pH试纸调节pH到6.8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min.以无菌操纵趁热将(A)(B)溶液平均混杂.2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml,1%草酸氨水溶液80ml.将两液混匀,放置24小时后过滤即可.2.2 卢哥氏碘液：碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml.先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后参加碘使之完整消融,再参加蒸馏水300ml即成.2.3 蕃红溶液：番红2.5g,95%乙醇100ml,消融后存于密闭的棕色瓶中.用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可.2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g,95%乙醇300ml;B液：0.01% KOH 100ml.混杂A和B液即成,按1：100稀释即可. 2.4 心理盐水：称取9g氯化钠,消融在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升.取1干净三角瓶,盛以225ml心理盐水;7只干净试管,各盛9ml的心理盐水;加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min,得到无菌心理盐水.将酸奶样品搅拌平均,用无菌移液管汲取样品25ml参加盛有225ml无菌心理盐水的三角瓶中,在旋涡平均器上充分振摇,使样品平均疏散,即为10-1的样品稀释液;将7只装9ml心理盐水的无菌试管,依次标识表记标帜 10-2.10-3.10-4.10-5.10-6.10-7,再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中,稀释混匀便得到10-2稀释液,如斯反复依次制得10-3～10-7的稀释液.取无菌平板12个,编号标明10-1.10-5.10-6.10-7各三套;将经高温消毒的造就基冷却到50℃阁下,按无菌操纵法倒12只平板,每皿约15ml;平置使造就基平均散布在皿底,待凝固.A．平板划线接种环挑取10-1菌液,按无菌操纵对标有”10-1”的3个平板进行划操纵;划线完毕后,盖上皿盖,倒置放在40℃恒温造就箱中造就48小时.B．平板涂布用三支1ml无菌移液管分别汲取10-5.10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml,对号接种于与之对应的3个无菌平板中,每个平皿放0.1ml;尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布平均,平放于实验台上20 Min;然后倒置于40℃恒温箱中造就48小时.直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克,水95克（蔗糖与水的比例在1：10的规模内）的比例配制,装量以试管的1/3为宜,115℃灭菌15min.恒温造就48小时事后,掏出造就平板;选择菌落散布较好的平板,先对其菌落形态进行不雅察,初步找出乳酸菌菌落.乳酸菌的菌落很小,大约1~3 mm,园形隆起,概况滑腻或稍光滑,呈乳白色.灰白色或暗黄色;在产酸菌落四周还能产生CaCO3的消融圈.40℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基变成黄色者初步定为乳酸菌.拔取乳酸菌典范菌落转致脱脂乳试管中,40℃造就8~24h若牛乳消失凝固,无气泡,显酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色显阳性,则可将其持续传代3次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用.发酵：不雅察BCG造就基中乳酸菌菌落特点,拔取长势比较好的菌落无菌操纵下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中,40～42℃静止造就.取清洁载玻片一块,在载玻片中心加一滴心理盐水,无菌操纵法取少量菌体涂片;结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染,湿润后用油镜不雅察,菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌;个中保加利亚乳杆菌呈杆状,成单杆.双杆或长丝状;嗜热链球菌,呈球状,成对或短链或长链状. 革兰氏阳性,无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌,记载测定成果.第二部分：乳酸菌判定一.实验器材1.蛋白胨水造就基：蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4121 摄氏度湿热灭菌 20 min2.糖发酵造就基：蛋白胨水造就基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液（葡萄糖,蔗糖）各10 ml.3.有关试剂1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml乙醇中,贮存于棕色瓶中保管备用.吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml.10 % 硫酸,2 % 高锰酸钾含氨的硝酸盐溶液：称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银消融后,掏出10 ml 备用,向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水,即可形成很厚的沉淀,持续滴加氨水至沉淀方才消融成为澄清溶液为止,再将备用的硝酸银慢慢滴入,则溶液消失薄雾,但轻轻动摇后,薄雾状的沉淀又消掉,持续滴入硝酸银,直到动摇后仍呈现稍微而稳固的薄雾状沉淀为止.二.判定实验采取牛肉膏蛋白胨造就基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下造就20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特点的不雅察.染色办法：涂片固定;草酸铵结晶紫染1分钟;自来水冲洗;加碘液笼罩涂面染约1分钟;水洗,用吸水纸吸去水分;加95%酒精数滴,并轻轻动摇进行脱色,20秒后水洗,吸去水分;蕃红染色液（稀）染2分钟后,自来水冲洗.湿润,镜检.2.发展前提实验(1)耐盐性实验(NaCl 浓度:0. 85 .1. 20 和1. 71) (mol/ L) ;(2)耐酸碱实验(p H :4. 3 .5. 7 .6. 8 .8. 4 .8. 6 和8. 7) ;(3)温度梯度实验(温度: 10℃.30℃.40℃.50℃.55℃.60℃和65℃) .分别将参试菌接种于以上处理的液体造就基中造就48 h ,记载发展状态.3.厌氧发展测定将菌种接入养分肉汤平板后,用密封带包好放入CO2造就箱37℃造就2天后,不雅察发展情形,发展则为阳性.含硝酸钾的养分肉汤参加2g硝酸钾入养分肉汤4.心理生化实验⑴过氧化氢酶测定将实验菌接种于PGY造就基斜面上,37℃造就20h—24h,取一环接种的造就物,涂于清洁的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反响,无气泡为阴性反响.蛋白胨.酵母膏.葡萄糖（PGY）造就基：蛋白胨10g,酵母膏5g ,葡萄糖1g,蒸馏水1L .(2)甲基红（M.R）实验接种实验细菌于PYG造就基,于37℃造就2天后,于造就物中参加几滴甲基红酒精溶液,如呈红色,暗示阳性.(3)吲哚实验1）.试管标识表记标帜：取装有蛋白胨水造就基的试管2支,分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比.2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔到标识表记标帜乳酸菌的试管中,标识表记标帜有空白对比的不接种,置37摄氏度恒温箱中造就24~48小时.3）.不雅察记载：在造就基中参加乙醚1~2 ml ,经充分振荡,使吲哚萃取至乙醚中,静置少焉后乙醚层浮于造就液的上面,此时沿管壁迟缓参加5~10滴吲哚试剂,若有吲哚消失,乙醚层呈玫瑰色,此为吲哚实验阳性反响,不然为阴性反响.(4).糖发酵实验1）.试管标识表记标帜：取分别装有葡萄糖,蔗糖发酵造就液试管各2支,每种糖发酵试管平分别标识表记标帜乳酸菌和空白对比. 2）.接种造就：以无菌操纵分别接种少量菌苔至以上各响应试管中,每种糖发酵造就液的空白对比均不接菌.将装有造就液的杜氏小管倒置试管中,置37摄氏度恒温造就箱中造就24小时,不雅察成果.3）.不雅察记载：与对比管比较,若接种造就液保持原由色彩,其反应成果为阴性;假如造就液呈黄色,反应成果为阳性.造就液中的杜氏小管内有气泡为阳性反响,杜氏小管内没有气泡为阴性反响.(5).乳酸的检测选用已经分别的菌种做小型发酵实验,取发酵液的上清液约10 ml于试管中,参加10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中,微火加热试管至沸,不雅察滤纸变更.（6）乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）接种新颖的实验菌种于造就基中, 37℃造就2天后,取葡萄糖蛋白胨造就液1mL在个中参加1ml 10％的NaOH,混匀,再参加3－4滴2%氯化铁溶液.数小时后,造就基概况的基层消失红色者,为阳性.（7）明胶液化实验将实验菌接种于明胶基本造就基中,置37℃造就,以一支未接种的试管作为对比.将接种的和未接种的对比管置于冰箱或冷水中,等待对比管凝固跋文录实验成果,反复不雅察比较多次.如对比管凝固时,接种管液化为阳性反响,凝固为阴性反响明胶造就基成分：NaCl 5g,蛋白胨10g,牛肉膏3g,明胶120g,蒸馏水1000mL.制法：在水浴锅中将上述成分熔解,不竭搅拌.熔解后调pH 7.2~7.4,121°C 灭菌30min.(8)石蕊牛奶的反响牛奶中重要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中参加石蕊是作为酸碱指导剂和氧化还原指导剂.石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则自上而下地褪色变白.不雅察其产酸.产碱.胨化.酸凝固.凝乳酶凝固.还原情形.。

乳酸菌的分离、纯化与鉴定第一部分:乳酸菌的分离、纯化一、实验器材:1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g;2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤:1、培养基配制(BCG牛乳培养基):(A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成)(B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。

以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。

2、药品配制2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。

将两液混匀,放置24小时后过滤即可。

2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。

2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。

用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。

2、4 0、1%的吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。

酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。

二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。

实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。

三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

大多数不运动，少数以周毛运动。

菌体常排列成链。

根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。

在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。

四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方蛋白胨 2.0g酵母膏 2.0g番茄汁40g葡萄糖 2.0g吐温0.10mL碳酸钙 3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。

②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。

依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。

③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。

④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。

⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。

3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。

用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。

然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。

酸奶中乳酸菌的筛选试验一、实验目的：熟悉从酸奶中分离和纯化乳酸菌的一般方法二、实验原理：市场销售的酸奶主要含乳酸菌，乳酸菌的主要作用是把牛奶中乳糖发酵成乳酸，此外酸奶中还含有其他球菌，利用它产酸等性质可以分离乳酸菌，分离培养基一般添加蛋白胨、酵母膏提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖为可发酵糖类；磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、亚硫酸铁、吐温-80和乙酸钠为培养各种乳酸菌提供生长因子，其成分还能抑制某些杂菌；琼脂是培养基的凝固剂。

、也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据。

.筛选方法：.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3 的培养基上产生CaCO3 溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3 的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH、更利于乳酸菌的生长和分离三、实验药品及仪器牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、乳糖、吐温-80、柠檬酸二铵、CaCO3 、K2HPO4 NaAc·3H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、琼脂、结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、石蜡、蒸馏水。

仪器：超净工作台、电子显微镜、接种环、恒温培养箱、接种环、培养皿、涂布环、高压锅、试管、微波炉、电子天平、离心机四培养基类型①改良MRS 培养基（乳酸菌分离培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1.0ml（它是一种很好的乳化剂和分散剂也就是说它的作用就是是培养基的营养成分更加的均匀就是对营养成分的再一次优化），K 2HPO4 2g，NaAc·3H2O 5g，柠檬酸二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，补蒸馏水至1000ml（固体培养基中加琼脂 1.5%-2%），调pH 至6.4±0.2，121℃高压灭菌15min②改良MC 培养基（乳酸菌选择培养基）：牛肉膏5g，蛋白胨5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，CaCO3 10g，琼脂20g，中性红0.05g（指示剂），最终pH6.5±0.2，补蒸馏水至1000ml，121℃高压灭菌15min。

乳酸菌的分离‎与纯化及土豆‎（大豆）发酵1．乳酸菌的种类‎、形态、生理生化特征‎乳酸菌指发酵‎糖类主要产物‎为乳酸的一类‎无芽孢、革兰氏染色阳‎性细菌的总称‎。

大多数不运动‎，少数以周毛运‎动。

菌体常排列成‎链。

在其发酵产物‎中只有乳酸的‎称为同型乳酸‎发酵，而产物中除乳‎酸外还有较多‎乙酸、乙醇、CO２等物质‎的称为异型乳‎酸发酵。

有微好氧菌和‎专性厌氧菌。

根据细胞形态‎为球状或杆状‎，可分为两大类‎，即乳酸链球菌‎族（Strept‎o cocce‎a e）和乳酸杆菌（Lactob‎a cille‎a e）。

乳酸链球菌族‎，菌体球状，通常成对或成‎链，在固体培养基‎上菌落较小，生长缓慢。

多数为同型发‎酵，如链球菌属（Strept‎o coccu‎s），是与人类关系‎密切的重要菌‎群，有些菌是人和‎温血动物的致‎病菌；有些是人体的‎正常菌群存在‎于口腔和肠道‎；有些是乳制品‎及植物发酵食‎品中的常用菌‎，常在食品工业‎中使用，如乳链球菌（S．lactis‎）。

少数为异型发‎酵，如肠膜状明串‎珠菌（Leucon‎o stocm‎e sente‎r oides‎）是制药工业上‎生产右旋糖酐‎（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工‎业的一种害菌‎，常使糖汁发粘‎稠而无法加工‎。

乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。

在BCG 牛乳培养基琼‎脂平板上，乳酸菌菌落大‎约1-3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍‎粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄‎色；在产酸菌落周‎围还能产生C‎aCO3的溶‎解圈。

乳酸菌革兰氏‎染色呈阳性，涂片镜检细胞‎杆状或链球状‎。

2.实验材料2.1试验设备天平1个、牛角匙、电炉1个、 pH试纸（1套）、 100ml量‎筒（2个）、漏斗、漏斗架（1套）、玻璃棒（2根）、棉塞、培养基（15个）、无菌移液管（3支）、牛皮纸（5张）、线绳、标签、 500mL锥‎形瓶3个、 250mL锥‎形瓶2个、试管20只、 500mL烧‎杯2个、 250mL烧‎杯2个、 100mL烧‎杯2个、酒精灯2个、石棉网1个、接种针（环）2个。