苯巴比妥钠诱导小鼠后血清与原代肝细胞培养物的生物学分析

・论　善・　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｒｅｓ．Ｏｃｔ　２００８．Ｖｏ１．３７　Ｎｏ．１０　

苯巴比妥钠诱导小鼠后血清与原代肝　

细胞培养物的生物学分析　

伍通和　陈南清　黄永清　陈爱静　石艳芬　

摘要　目的探讨经苯巴比妥钠（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ，ＰＢＳ）体内预诱导的成年动物肝细胞的生物学特征，研究效应肝细　胞在生物人工肝（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ，ＢＬ）与其他ｌ临床应用的潜在价值。方法　１２只成年雄性小白鼠随机分为预诱导组与对照组。　预诱导组每日１次腹腔内注射ＰＢＳ　４５ｍｇ／ｋｇ，共７次；对照组注射Ｎｓ。预诱导结束后两组小鼠做如下分析：检测血清总蛋白　（ＴＰ）、尿功能素氮（ＢＵＮ）、胆固醇（ＣＨＯＩ　）、高密度脂蛋白胆固醇（ＨＤＬＣ）合成量；分离肝细胞培养４８ｈ后取培养液做同上４项生　化分析；培养２４ｈ的肝细胞做ＭＴＴ检测细胞增生活性；染色体显示法观察细胞分裂状况，以及肝细胞培养的存活期限和一般形　态学观察。结果　实验组血清ＴＰ与对照组有显著差异（ｔ＝２．６７８，Ｐ＜０．５）。两组肝细胞培养液中ＴＰ、ＢＵＮ、ＣＨＯＩ　、ＨＤＬＣ含量　差异无统计学意义。ＭＴＴ实验两组的培养增生活性无显著差异。培养的生存期限均不超过７２ｈ，细胞一般形态未见变化差异。　结论ＰＢＳ预诱导可明显提高成年鼠血清ＴＰ含量和肝细胞的其他生物活性，有利于我们加深对ＰＢＳ效应肝细胞在生物人工肝　与其他临床应用潜能的探讨。　关键词苯巴比妥钠预诱导成年鼠总蛋白　

Ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　Ｃｏｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　Ｓｏｄｉｕ．　Ｗｕ　Ｔｏｎｇｈｅ，Ｃｈｅｎ　Ｎａａｑｉｎｇ，　Ｈｕａｎｇ　Ｙｏｎｇｑｉｎｇ，Ｃｈｅｎ　Ａｉｊｉｎｇ，Ｓｈｉ　ｙｎ　ｎ．ＬｏｎｇＹａｎ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＦｕＪｉａｎ　３６４０００，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｔｉｃｓ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　ａｎｉｍａｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ　（ＰＢＳ）ｉｎ　ｖｉｖｏ，ａｎｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｔｏｅｙｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１　２　ａｄｕｌｔ　ｍａｌｅ　ｍｉｃｅ，ａｒｅ　ｙａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎ　ｔｏ　ｐｒｅｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｅｏｎｔｒｏｌｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ａｒｅ　ｉｎｔｒａｐｅ　ｒｉｔ０ｎｅａｌｌｙ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ＰＢＳ　ｐｅｒ　ｄａｙ，４５　ｍｇ／ｋｇ　ｆ０ｒ　７　ｔｉｍｅｓ　ｉｎ　ｔｏｔａｌ；ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌ　ｗａｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ＮＳ．ａｆｔｅｒ　ｔｈａｔ，ｗｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｓｅｌｕｍ　ＴＰ，ＢＵＮ，ＣＨＯＬ，ＨＤＬＣ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｖｅ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ　ｗａｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　４８ｈ；ＭＴＴ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｅｙｔｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｄｅ—　ｖｅｌｏｐｅｄ　２４ｈ；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｄｅａｄｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－　ｓｕｉｔｓ　Ｔｈｅ　ＴＰ　ｈａｄ　ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ（ｔ＝２．６７８，Ｐ＜０．５）．Ａｃｔｉｒｉｔｙ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｆｏｕｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ＭＴＴ　ｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｄｅａｄｌｉｎｅ　ｄｉｄ　ｎｏｔ　ｓｕｒｐａｓｓ　７２ｈ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｗａｓ　ｎｏｒｍａ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＰＢＳ　ｃａｎ　ｒａｉｓｅ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｓｒｅｍ　ＴＰ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　ｍｉｃｅ　ｓｉｇ—　ｎｉｆｉｅａｎｔｌｙ，ａｎｄ　ｉｔ　ａｌｌｏｗ　ＵＳ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ＰＢＳ　ｉｎ　ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ（ＰＢＳ）；Ｐｒｅｉｎｄｕｅｅ；Ａｄｕｌｔ　ｍｉｃｅ；Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

生物人工肝（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｌｉｖｅｒ，ＢＬ）在终末期肝脏　

疾病中起“桥梁”作用直至病人获得肝移植或自身恢　

复，在此肝细胞材料是ＢＬ的重要核心部分。目前国　

内主要是应用中国实验小型猪的胚胎肝细胞、新生肝　细胞与其他永生性肝细胞株（如ｃ　Ａ等），但胚胎肝　

细胞与新生肝细胞不表达或低表达葡萄糖一６一磷酸　

酶，细胞色素Ｐ４５０等生物转化酶很弱，永生性肝细胞　

株存在肿瘤基因转染的风险且生物功能仍欠完善，而　

对正常成年动物肝细胞（ａｄｕｌｔ　ａｎｉｍａｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，　

ＡＡＨ）的研究报道较少。本课题组近年来致力于　ＡＡＨ在生物人工肝应用的探讨，近期又报道了经苯　

作者单位：３６４０００福建省龙岩市第二医院人工肝治疗中心　

－７２・　巴比妥钠（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ，ＰＢＳ）体内预诱导的　

ＡＡＨ在体外原代培养实验时能显著提高人体重型肝　

炎血清胆红素的代谢活性，拓展了ＰＢＳ效应的ＡＡＨ　在生物人工肝潜在的应用价值。在本实验中，我们进　

一步探讨了经ＰＢＳ诱导的ＡＡＨ其他生物学特征，为　

后续相关研究提供实验视野。　

材料与方法　１．主要材料与设备：雄性昆明种小白鼠，清洁级，３个月　

龄，购于中科院上海实验动物中心。ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ：Ｄ６１７１、Ｉ　

６６３４、Ｇ７５１３、Ｍ５６５５。　２．方法：（１）体内预诱导：１２只成年雄性小白鼠平均体重　３６ｇ，随机分为预诱导组与对照组各６只。预诱导组每日１次　腹腔内注射ＰＢＳ，４５ｍｇ／ｋｇ，对照组每日１次腹腔内注射Ｎｓ，

　医学研究杂志２００８年ｆ０月　第３７卷　第１０期　・论　善・　

０．１５ｍｌ／只，共７次。预诱导期问两组小白鼠ｌＩＦ常进食，自由　饮水，使用的药物剂量未见小白鼠出现异样反常。（２）分离血　清：末次给药的２４ｈ后心内采血分离血清用于生化分析，采血　后取肝脏分离肝细胞用于培养。（３）肝细胞分离：方法参见文　献［１］。按细胞培养无菌操作常规两组实验鼠分别操作，从同　组的每只实验鼠中各获取０．５ｇ湿重的肝脏混合，用眼科剪分　剪成１ｍｍ　大小的组织块同时用Ｈａｎｋ’ｓ液洗去红细胞，在含　１Ｏ％胎牛血清的ＤＭＥＭ液中轻柔挤压过８０日分样筛，收集肝　细胞混悬液用２００目分样筛滤过，收集滤过的肝细胞混悬液　在４℃、５０ｇ离心力巾洗涤２次，斤】台盼兰染色排除法检测细　胞成活率约为９０％，再次离心沉淀细胞并吸尽离心管内的洗　涤液。两组均用』－法各自获得６只实验鼠混合的肝细胞待用　（务必注意在末次离心洗涤后庸倾斜离心管尽量吸除洗涤液，　以叩击离心管能使管底沉淀的肝细胞分散均匀为佳，可使预　诱导组与对照组肝细胞各自在离心管内的密度保持基本一　致，避免下一步骤从管内吸取肝细胞时　细胞数量不一而造　成实验误差）。（４）培养：两绀各自在９６孔平底培养板内用移　液器加入每孔３０　Ｉ的肝细胞混悬液，随后各孔均加入７０＆ｌ　含胰岛素与１０％胎牛血清的高糖型ＤＭＥＭ培养液，使各孔终　体积为１００＆ｌ，置于３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ，培养箱中静置培　养。为避免ｆ扰因素，全部实验末使用胶原基质、细胞因子、　生长激素以及抗生素。（５）生化分析：分别以两组小鼠血清和　培养４８ｈ后的肝细胞上清液用贝克曼全自动生化仪分析总蛋　白（ＴＰ）、尿素氮（ＢＵＮ）、月日同醇（ＣＨＯＬ）、高密度脂蛋白胆固　醇（ＨＤＬＣ）合成量。（６）ＭＴＴ实验：方法参见文献［２］。每个　培养孔加ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ，三蒸水配制，０．２　ｍ过滤除　菌）２０＆ｌ，置培养箱内培养４ｈ，培养结束后小心吸弃培养孔内　全部液体，每个培养孔加１５０ｇ］ＤＭＳＯ，在３７℃恒温振荡仪做　４５次／ｒａｉｎ平稳振荡１０ｒａｉｎ，用ＡｌｉＳｅｉ全自动酶免分析仪以　４９０ｎｍ波长测定各孔的光吸收值。两组细胞活力直接　光吸　收值作比较。（７）一般情况观察：在倒置镜下观察肝细胞培养　的存活期限和ＨＥ染色观察细胞的一般形态。　３．统计学分析：文验相关数据用（　±ｓ）表示，绍问差异用　ｔ值检验。　结　果　１．血清生化：结果见表１。　

表１　苯巴比妥钠诱导后血清生化检测结果（　±ｓ．ｎ＝６）　

两组总蛋白的比较Ｐ＜０．０５，ｔ＝２．６７８　

２．培养液生化：结果见表２。　

３．ＭＴＴ实验：结果见表３。　

４．细胞培养的一般情况：两组肝细胞培养的生　存期限均不超ｘ￣＿７２ｈ，细胞一般形态未见变化差异。　表２　两组肝细胞培养后上清液血清　生化检测结果（　±Ｓ，ｎ＝６）　

两组生化比较无明显的差别　

表３两组肝细胞培养的增生活性比较（ＭＴＴ法）　组别　光吸收值（　±Ｓ，ｎ＝６，Ａ＝４９Ｏｎｔｏ）　实验组　对照组　０．２６３±０．００４　０．２５ｌ土Ｏ．Ｏ１０　

两组对光吸收值的比较无明显差异　

讨　论　

生物人工肝的发展应用受限于肝细胞材料，由于　

人源性肝细胞取材的受限，因此目前国内外众多作者　

各有不同的实验种类，在现阶段尚未见比较理想的实　

验结果。从目前国内的一组研究结果分析，我们认为　正常的ＡＡＨ应较为理想，这是因为ＡＡＨ生长期长，　

各系统生物功能均已发育完全，其肝细胞有较成熟与　稳定的代谢酶系统，各种生物功能均已完善具备，有　

着胚胎肝细胞、新肝细胞、肿瘤细胞株以及永生化细　

胞株不可替代的长处　；其中新鲜分离的ＡＡＨ对胆　红素代谢等功能明显较冻存复苏的ＡＡＨ应更具活　

性　一　；预培养的ＡＡＨ对胆红素代谢的活性仍不如　新鲜分离的ＡＡＨ［６１；而经ＰＢＳ体内预诱导的ＡＡＨ在　

体外实验中更显示对胆红素代谢的高活性，因此，进　

一步探讨ＡＡＨ的可诱导性的生物细胞功能，将对我　们提升ＡＡＨ在ＢＬ中的作用地位将是大有益处的。　

肝脏的实质性肝细胞的生物功能可被ＰＢＳ诱导　

而明显提高，例如刺激滑面内质网可使多种代谢酶系　统大量增生，使肝细胞对有机物异物的生物转化效应　

增强；在人体内可诱导提高胆红素载体蛋白的产生，　

主要用于治疗肝内瘀胆与非结合性高胆红素血症，体　外培养的肝细胞被诱导可用于观察色素药物代谢酶　

的活性；本实验的目的在于承接本课题组前期的实验　研究，深入探讨经ＰＢＳ体内预诱导的ＡＡＨ的生物学