创伤和感染所致多器官功能障碍综合征大鼠血栓调节蛋白的动态表达
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创伤和感染所致多器官功能障碍综合征大鼠血栓调节蛋白的动态表达
滕林李俊明余旻方明余静袁玉荣汤华莫莉花井景刘先哲
(三峡大学人民医院湖北省宜昌市第一人民医院心血管内科，湖北宜昌443000)
〔摘要〕目的动态监测创伤和感染所致多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠血栓调节蛋白(TM)的表达变化，探讨TM在MODS早期器官损伤诊断中的作用。方法实验在三峡大学医学院实验中心完成。将40只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(8只)、MODS模型组(32只)，模型组又分为造模后6、12、24、48h不同时相，每组8只。采用“二次打击”即眼球失血加腹腔注射脂多糖(LPS)制备MODS模型:大鼠左眼球取血2ml/100g，在放血4h后予无菌腹腔注射LPS5mg/kg，正常对照组予以腹腔注射等量的生理盐水，造模完成后在不同的时相点搜集标本。光镜观察肺、肾、肝组织的形态结构变化;采用ELISA法检测MODS不同时相血清中TM的浓度变化;免疫组化法检测TM在MODS肺、肾、肝组织中的表达。结果正常对照组肺、肝、肾组织结构无改变;MODS各组肺、肾及肝组织损伤较重。与正常对照组相比，血清TM的阳性表达6h组有所增加(P＜0.01)，12h达到高峰(P＜0.01)，随后24～48h下降，与正常对照组比较均有显著性降低(P＜0.01～0.05)。与正常对照组相比，肺、肾及肝组织TM的阳性表达6h组有所增加，12h达到高峰(P＜0.01)，随后24～48h下降。结论高表达的TM参与了MODS器官损伤的病理过程，可能作为早期组织器官损伤重要的监测指标。〔关键词〕多器官功能障碍综合征;血栓调节蛋白;脂多糖;全身炎症反应综合征;创伤;感染;大鼠〔中图分类号〕R64〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202(2012)05-1005-03;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2012.05.053
通讯作者:李俊明(1973-)，男，副主任医师，副教授，博士，主要从事重症医学研究。第一作者:滕林(1980-)，男，医师，在读博士，主要从事重症医学研究。多器官功能障碍(MODS)的发病机制主要是由于过度的炎
症反应而导致内皮细胞损伤。血栓调节蛋白(TM)广泛分布于
血管内皮细胞质膜表面，生理状态下可少量从内皮表面水解脱
落，游离于血浆中，当内皮细胞损伤时，则引起TM大量释放入
血，是内皮细胞受损的特异性分子标志物之一〔1〕，现已广泛用
于临床疾病如心脑血管、糖尿病肾病、烧伤、肿瘤等研究，但目
前有关TM与MODS早期器官损伤的关系报道少见。本研究
旨在探讨TM在MODS组织器官损伤中的作用，为早期诊断
MODS、防止组织器官的损伤提供新的理论基础和靶点。
1材料与方法
1.1实验动物40只健康雄性SD大鼠，体重250～300g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，符合国家医用动
物使用标准〔许可证号:SCXK(鄂)2004-0007，级别:SPF〕。动
物予以标准饲料喂养，自由摄食饮水，22～30℃条件下饲养2w
后实验，实验前禁食12h，禁饮4h。
1.2材料脂多糖(LPS，E.coli.O55:B5)由美国Sigma公司
提供;血清TMELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提
供;TM抗体以及免疫组化试剂盒均由武汉博士德试剂公司提
供;戊巴比妥钠粉剂，国药集团化学试剂有限公司;甲醛溶液，
上海化学试剂厂。日本Olympus公司光学显微镜;德国Leica
公司TP1020型脱水机，CM1800型恒冷箱切片机，ULTRACUT
R型超薄切片机及DMR型多功能显微镜及图像分析系统。以
上试剂置4℃冰箱保存。
1.3动物的分组和模型制备按随机数字表法将大鼠分为正
常对照组(8只)、MODS模型组(32只)，模型组又分为造模后
6、12、24、48h不同时相，每组8只。参照并改良陈德晖“二次
打击”〔2〕方法和标准制备MODS大鼠模型:采用左眼球取血
2ml/100g，4h后以5mg/kg无菌腹腔注射LPS。对照组予以腹腔注射等量的生理盐水。造模后在各时相点将动物腹腔注
射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，常规消毒皮肤，对应时间
点迅速打开胸腔及腹腔，心脏采血4ml，离心提取血清，冰箱保
存，备查TM;分别取适量肺、肾及肝组织，用生理盐水洗去血
液，按免疫组化和光镜病理切片要求置于10%中性甲醛溶液固
定，尽量做到取材部位大致相同。
1.4病理学检查将所取组织浸泡在10%中性甲醛液中固
定24h，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm厚。
切片贴于经10%多聚赖氨酸处理过的玻片，60℃烤片过夜。取
出备HE染色及免疫组化用。光镜下观察并照相。
1.5检测指标ELISA法检测血清中TM的浓度。免疫组织
化学法检测肾组织中TM的浓度。
1.6统计学处理采用SPSS10.0软件包，计量数据用x±s
表示，先进行数据的正态分布检验方差齐性检验，组间比较采
用单因素方差分析(SNK法)。
2结果
图1正常对照组与MODS模型组不同时相点肺、
肾和肝组织病理形态变化(HE，×200)2.1病理形态学检查正常对照组肺、肾及肝组织结构无改
变或轻微变化，MODS组各组织均损伤较重。①在MODS模型
组肺组织中，6h可见肺间隔充血水肿，大量中性粒细胞浸润，
部分肺泡腔塌陷;12～24h炎性改变更加明显，肺间隔明显增
宽，血管扩张，肺间质大量淋巴细胞和组织细胞浸润，48h较
12h有所减轻，肺间质增厚，血管扩张，充血，部分肺泡腔及间
质见陈旧性出血。②在MODS模型组肾组织中，6h可见肾单
位萎缩，大小不一，部分代偿性扩大。12～24h肾小球内出血，
炎症细胞浸润，近曲小管浊肿，肾间质血管扩张，充血，肾小管
上皮浊肿，集合管出血，集合管间质血管扩张，48h肾小球扩张
充血，少部分肾小球萎缩，肾小管上皮轻度浊肿。③在MODS
模型组肝组织中，6h可见肝细胞轻度浊肿，中央静脉压迫狭
窄，肝血窦扩张，轻度纤维组织增生，12～24h肝细胞大片状坏
死，浆细胞浸润，肝细胞浊肿，肝血窦显著扩张，枯否氏细胞增
生，可见肝细胞核固缩，再生现象，48h偶见肝细胞坏死灶，肝
细胞轻度浊肿，有双核，新生的肝细胞。见图1。2.2血清中TM蛋白表达与正常对照组血清TM水平
〔(8.8±1.50)ng/ml〕比较，造模后6～12h，MODS大鼠明显增
高〔(46.11±0.36)、(51.78±1.49)ng/ml，P＜0.01〕，其峰值
见于造模后12h(P＜0.01)，随后24～48h下降至正常以下
〔(4.56±0.58)、(5.20±1.14)ng/ml，P＜0.01，P＜0.05〕，而
48h较24h有轻微的升高。
2.3免疫组织化学法检测组织中TM的蛋白表达各组大鼠
肺、肾及肝组织中均能观察到TM的阳性表达(见图2)。与正
常对照组比较，TM在各个组织的阳性表达6h组均有所增加，
12h达到高峰(P＜0.01，P＜0.05)，随后24h下降(P＜0.05)，
至48h与正常对照组无显著差异，但略高。见表1。
表1正常对照组与MODS模型组肺、肾及肝组织
TM阳性染色平均光密度比较(x±s，n=8)
组别肺肾肝
正常对照组100.14±16.7178.43±7.3397.25±12.68
MODS6h组113.27±11.322)83.24±10.52109.10±14.662)
MODS12h组126.74±18.221)95.39±13.992)119.57±15.221)
MODS24h组118.20±10.232)90.17±9.882)107.29±10.712)
MODS48h组108.58±17.1486.11±10.13101.86±9.97
与正常对照组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05
图2正常对照组与MODS组肺、肾及组织中
TM的表达变化(DAB，×400)
3讨论
TM是由内皮细胞表达于细胞膜外表面的一种凝血酶结合
蛋白，广泛分布于动脉、静脉、毛细血管及淋巴管的内皮内，尤
其是在肺、肾及胎盘组织中。在伴有内皮细胞损伤的疾病中，
血浆中TM含量均可升高，因此，TM常被认为是内皮细胞损伤
的重要分子标记物，它的水平变化不仅可用于判断血管内皮细
胞受损程度，而内皮细胞的受损程度可反映器官功能障碍的程
度，而且在一定程度上可预测病情的转归〔3〕。
Gando等〔4〕发现TM在DIC患者尤其是DIC死亡患者中明
显升高，而且TM的峰值水平与最高的DIC评分和MODS评分
呈显著正相关，提出在脓毒症患者中，与内皮细胞损伤有关的
炎症和凝血的激活是DIC和MODS发生的重要原因。国内罗·6001·中国老年学杂志2012年3月第32卷思敏等〔5〕发现20例MODS死亡标本的心、肝、肾血管内皮细胞
组织型TM表达为阳性和强阳性，提出TM增加导致的凝血平
衡失调可能是MODS的发病机制之一。TM对脓毒症和MODS
而言是一个高度敏感的指标〔6〕。
本实验提示在MODS早期，特别是在创伤继续感染后6h，
内皮细胞就已经出现损伤，此时间段可能是组织器官功能由损
伤到衰竭的转折点，若在此期间能及时做出诊断和采取必要的
药物和支持治疗，对于防止和保护各个组织器官损伤加重和病
情恶化具有非常重要的意义。血管内皮损伤后修复较为迅速，
本实验中24～48h开始下降并降至正常以下，提示血管内皮细
胞的功能有所恢复，而肺、肾、肝组织TM的阳性表达与血清中
变化及病理学损伤趋势相一致，根据免疫组化结果显示，TM在
肺及肝组织中表达较肾组织明显，考虑可能与组织表达的特异
性有关。因此，检测血清TM的水平对MODS早期诊断的敏感
度较高，但特异性可能存在不足，不能完全代表各个组织器官
损伤的程度，需结合临床必要的诊疗手段。但是在MODS的早
期，检测血清TM上升的幅度可以作为器官损伤的诊断及预测
指标，而组织器官中TM浓度持续升高也可能是预后不良的征
兆，有利于预后的判断。4参考文献
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