鳜嗜水气单胞菌GYK1株胞外产物提取、纯化及生物学活性分析

乳酸杆菌溶胞物的提取及在化妆品的应用研究 目录 1. 内容概要................................................2 1.1 乳酸杆菌概述.........................................2 1.2 乳酸杆菌溶胞物.......................................3 1.3 化妆品行业应用趋势...................................3 2. 实验材料与方法..........................................4 2.1 材料及试剂...........................................5 2.1.1 乳酸杆菌株.......................................6 2.1.2 实验用缓冲系统...................................7 2.1.3 其他化学试剂与酶.................................7 2.2 实验设备.............................................8 2.2.1 分离及纯化设备...................................9 2.2.2 分析仪器........................................11 2.3 实验方法............................................12 2.3.1 乳酸杆菌细胞的培养..............................12 2.3.2 乳酸杆菌溶胞物的提取............................14 2.4 分析与表征技术......................................15 2.4.1 电泳与质谱分析..................................16 2.4.2 粒子数量与直径的测定............................16 2.4.3 溶胞物稳定性和活性测试..........................17 3. 结果与分析.............................................18 3.1 乳酸杆菌溶胞物的提取效率比较........................19 3.2 溶胞物的纯度与稳定性评价............................20 3.3 溶胞物应用于化妆品的效果评估........................21 3.3.1 保湿与护肤效果..................................22 3.3.2 老化皮肤修复....................................23 3.3.3 香气成分与生物活性分析..........................24 1. 内容概要 本研究旨在探讨乳酸杆菌溶胞物的提取方法及其在化妆品领域的应用。乳酸杆菌溶胞物是一种具有生物活性的物质，能够改善皮肤的生理功能，促进皮肤健康。本研究首先介绍了乳酸杆菌溶胞物的来源、结构和生物活性，然后详细阐述了乳酸杆菌溶胞物的提取方法，包括样品处理、细胞破碎、过滤和浓缩等步骤。本研究探讨了乳酸杆菌溶胞物在化妆品中的应用，如护肤品、洗发水、沐浴露等，并分析了其在化妆品中的作用机制和效果。通过本研究，可以为乳酸杆菌溶胞物在化妆品领域的应用提供理论依据和技术指导。

重楼的组织培养1.外植体的选择与消毒1.1外植体的选择据李群等对重楼组织培养外植体有4个取材时期，即萌芽期、展叶期、花冠露白期和倒苗期，子房取自花冠露白期，叶片取自萌芽和展叶期，幼芽取自萌芽期、展叶期、倒苗期，试验结果表明，其中以展叶期旺盛生长的根茎作外植体，其愈伤组织的诱导频率最高，达16.6%，萌芽期取材次之，在花冠露白期和倒苗期，根茎则很难诱导产生愈伤组织。

根和叶片既不能诱导出愈伤，也不能诱导出小球茎，接种后很少启动，污染也较少，大约2个月后干枯死亡。

而根茎、子房、幼芽都能不同程度地诱导出愈伤组织，特别是幼芽，不但诱导出的愈伤组织块数最多，诱导频率最高，达68. 25%，且还能诱导出小球茎。

可见，不同的外植体的诱导频率差异很大。

在四川峨眉山海拔2000 m左右的环境下，重楼属植物的生长期一般为4月至5月中下旬，大约二个月左右的时间。

因此，取材时间应在4月至5月上旬这段时间。

但在这段时间取材培养，会发现外植体极易污染。

必须采取一些措施减轻或控制外植体的污染。

.1.2外植体的消毒接种前置于18 e 弱光下保存，一般滞留2-4d即接种培养。

取重楼的芽，自来水冲洗2-3h，去除表层的芽鞘，再用自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。

在无菌条件下，用75,酒精消毒30S，无菌水冲洗3-5次，0.1,升汞灭菌15min，无菌水冲洗5-8次。

将芽外部的芽鞘按层剥下，切成长宽分别为1cm 左右的小块，芽内部不能分层的部分按切外层芽鞘的大小切成小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，一般幼嫩的芽和叶片灭菌3-4min;根茎灭菌10min，子房和根灭菌6-8min。

灭菌以后的材料用无菌水清洗3-5次，最后接种于培养基(1)上，置于(20?2 )?培养温度，光照时间8h/d的条件下培养。

培养基:(1)MS+BA 1.0 +IAA 2.0 和 MS+BA 2.0 +IAA 1.0 培养基上，不但能诱导愈伤组织，还能诱导出小球茎。

很好，需要好好研究一下原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性研究刘姝灵， 税 剑， 马小华， 潘建华， 石国民， 喻 容， 周前选， 龙江文， 易一行， 向延根摘要：目的探讨肺炎克雷伯菌胞外多糖的抗生物膜活性。

方法 96孔板筛选分泌具有抗表皮葡萄球菌生物膜活性物质的肺炎克雷伯菌菌株；煮沸法、酶处理法、高碘酸钠氧化法分析抗生物膜活性物质的化学性质；乙醇法粗提胞外多糖，浓硫酸-苯酚法测定肺炎克雷伯菌胞外多糖含量，稀释法探索抗生物膜活性是否具有浓度依赖性；结晶紫染色法检测肺炎克雷伯菌胞外多糖的广谱抗生物膜活性。

结果 20株肺炎克雷伯菌临床菌株上清液对表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜具有不同程度的抑制，抑制率为16.1%～73.5%；上清液中抗生物膜的活性物质为多糖；生物膜抑制率为73.5%，菌株粗提多糖含量为200.1 mg/L，此菌株胞外多糖对表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用具有浓度依赖性；该多糖对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌临床菌株生物膜具有显著抑制作用（P＜0.05）。

结论检出一种具有广谱抗细菌生物膜活性的肺炎克雷伯菌胞外多糖，该多糖抑制生物膜的效果具有浓度依赖性。

关键词：肺炎克雷伯菌；胞外多糖；抗生物膜活性中图分类号：R378.99 文献标识码：A 文章编号：1009-7708 ( 2021 ) 03-0303-06DOI: 10.16718/j.1009-7708.2021.03.011Anti-biofilm activity of Klebsiella pneumoniae extracellular polysaccharideLIU Shuling, SHUI Jian, MA Xiaohua, P AN Jianhua, SHI Guomin, YU Rong, ZHOU Qianxuan, LONG Jiangwen, YI Yihang, XIANG Yangen（Department of Laboratory Medicine, Changsha Central Hospital Affiliated to University of South China, Changsha 410004, China）Abstract: Objective To examine the anti-biofilm activity of Klebsiella pneumoniae extracellular polysaccharides. Methods The K. pneumoniae strains secreting active substances for inhibiting Staphylococcus epidermidis biofilm formation were screened out on 96-well plate. The chemical properties of the active substances were characterized by boiling, enzyme method, and sodium periodate oxidation method. The extracellular polysaccharides were extracted by ethanol method. The content of K. pneumoniae extracellular polysaccharides was assayed by concentrated sulfuric acid-phenol method. Dilution method was used to investigate whether the anti-biofilm activity was concentration-dependent. The broad-spectrum anti-biofilm activity of K. pneumoniae extracellular polysaccharides was analyzed by crystal violet staining. Results The supernatant of 20 clinical K. pneumoniae strains inhibited the biofilm formation of S. epidermidis ATCC 35984 with inhibition rate of 16.1%-73.5%. The active anti-biofilm substance in the supernatant was identified as polysaccharides. The crude polysaccharide content was 200.1 mg/L in the strain showing a biofilm inhibition rate of 73.5%. The inhibitory effect of the extracellular polysaccharides of this strain on S. epidermidis biofilm formation was concentration-dependent. The polysaccharide had significant inhibitory effect on the biofilm formation in clinical strains of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, S. epidermidis and Staphylococcus aureus (P < 0.05). Conclusions An extracellular polysaccharide of K. pneumoniae was identified with broad-spectrum anti-biofilm activity. The inhibitory effect of this polysaccharide on biofilm formation is concentration-dependent.Keywords:Klebsiella pneumoniae,extracellular polysaccharide,anti-biofilm activity·论著· 基金项目：湖南省卫生和计生委员会科研课题（132016156）。