粮食加工２００７年第３２卷第３期
收稿日期：２００６－１２－１２作者简介：罗松明（１９７７－），男，四川南充人，硕士，助教，主要从事粮油食品加工与质量安全方面的教学与科研工作。真菌（Ｆｕｎｇｉ）是一类有细胞壁、不含叶绿素、无
根叶茎、以腐生或寄生方式生存、能进行有性或无性
繁殖的微生物。真菌毒素（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ）是真菌产生的
次级代谢产物，目前已知有３００多种。其中对人类
危害最大、人类也研究最多的真菌毒素主要有：黄曲
霉毒素，主要是黄曲霉毒素Ｂ１和Ｍ１（ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ，ＡＦＢ１、ＡＦＭ１）；赭（棕）曲霉毒素Ａ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎＡ，Ｏ－
ＴＡ）；杂色（柄）曲霉毒素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ）；展青霉
毒素（ｐａｔｕｌｉｎ，ＰＴＬ）；黄绿青霉毒素（ｃｉｔｒｅｏｖｉｒｉｄｉｎｅｔｏｘ－ｉｎ，ＣＩＴ）；玉米赤霉烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，ＺＥＡ（Ｆ－２））；串珠
镰刀菌毒素（ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｎ，ＭＦ）三硝基丙酸以及属于
单端孢霉烯族化合物（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）的Ｔ－２毒素（Ｔ－２ｔｏｘｉｎ，Ｔ－２）；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）
（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＤＯＮ）；二乙酰镳草镰刀菌烯醇（ｄｉ－
ａｃｅｔｏｘｙｓｃｉｒｐｅｎｏｌ，ＤＡＳ）；麦角胺（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）；细交链
孢菌酮酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃａｃｉｄ）等［１］。这些真菌毒素不仅可
以污染食品引起食物中毒，而且有些还具有致癌、致
畸、致突变作用，对人类健康造成极大威胁。
１ＬＣ－ＭＳ联用
目前检测真菌毒素的国标方法主要以薄层色谱
法、酶联免疫法为主。近年来，气相色谱法、高效液
相色谱法已经成为现代仪器分析的应用最为广泛的
方法。而色谱－质谱联用技术结合了色谱、质谱两者
的优点，已经成为仪器分析进展的热点。液相色谱（ＬＣ）可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和
大分子化合物（包括蛋白质、脂肪、多糖及多聚物
等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱（ＭＳ）
作为理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的
检测灵敏度。因此ＬＣ－ＭＳ联用长期为人们所关注。粮油食品中真菌毒素的ＬＣ－ＭＳ法检测
罗松明１，肖付刚２
（１．四川农业大学工学院食品科学系，四川雅安６２５０１４；２．江南大学食品学院，江苏无锡２１４０３６）
摘要：粮油食品中常见的真菌毒素有：黄曲霉毒素、赭（棕）曲霉毒素、展青霉毒素、玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌毒素及脱氧雪腐镰刀菌烯醇等，因含量较低，用常规方法检测不出来。用ＬＣ－ＭＳ检测，灵敏度高、前处理比较简单，结果准确可靠，在检测食品中真菌毒素上前景广阔。关键词：液－质联用；真菌毒素；ＬＣ－ＭＳ检测法中图分类号：ＴＳ２０７．５文献标识码：Ａ文章编号：１００７－６３９５（２００７）０３－００９５－０４
ＬＣ－ＭＳ检测主要分３步：提取，净化，上机分
析。提取试剂一般用有机溶剂。可供选择的净化柱有
填充硅镁吸附剂或硅胶的固相萃取柱（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＰＥ）、免疫亲和柱（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ，
ＩＡＣ）、多功能净化柱（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎｃｌｅａｎｕｐｃｏｌｕｍｎ，
ＭＦＣ）［２］。
２ＬＣ－ＭＳ在检测食品中真菌毒素中的应用
２．１黄曲霉毒素的检测
黄曲霉毒素（ＡＦ）是由黄曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）
和寄生曲霉（Ａｐａｒａｓｉｔｉｃｓ）所产生的１组毒性代谢产
物。目前已分离出２０多种，根据它们在紫外光下发
出的荧光颜色分为２大族，即Ｂ族和Ｇ族。ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１和ＡＦＧ２是４种基本的黄曲霉毒素，其
余均为衍生物。从化学结构上看，所有ＡＦ具有相同
的基本结构，它包括１个双呋喃环和１个氧杂酮，前
者为毒性结构，后者具有加强毒性及致癌作用。其中ＡＦＢ１被公认为是目前致癌力最强的天然物质。ＡＦ
常常存在于土壤、动植物及各种坚果中，特别是花生
和核桃中，在大豆、玉米、奶制品及食用油等制品中
也经常发现ＡＦ。各国大都制定了相关法律来限定其
在食品中的含量。例如，欧盟国家规定，要求人类生
活消费品中的ＡＦＢ１的含量不能超过２μｇ／ｋｇ，总量
不能超过４μｇ／ｋｇ；牛奶和奶制品中的含量不能超过０．０５μｇ／ｋｇ［３］。中国也制定了ＡＦＢ１限量标准。
林建忠等［４］用ＬＣ－ＭＳ测定食品中的ＡＦＢ１。使用ＡＰＩ３０００三级四极杆质谱系统和Ａｇｉｌｅｎｔ液相系统（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００）。色谱柱为ＥＣＮｕｃｅｏｄｕｒ１００－５Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）；流动相：１０ｍｍｏｌ／Ｌ，乙酸铵︰甲
醇的体积比３︰７；流速：８００μＬ／ｍｉｎ。质谱采用ＥＳＩ
源，正离子反应监测模式，前级离子ｍ／ｚ＝３１３．０，二级
离子ｍ／ｚ＝２８５．３。样品经ＡＦ
免疫亲和柱纯化后用９５
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ＬＣ／ＭＳ进行测定。质谱系统稳定的情况下，可在１ｈ
之内检测大部分食品中的ＡＦＢ１并给出灵敏可靠的
结果。本法在添加０．５０￣５．０μｇ／ｋｇ的ＡＦＢ１时回收率
为６０％～９０％，相对标准偏差为９．６２％，检测限达０．０５μｇ／ｋｇ，可满足欧盟最新限量要求。Ｖｅｎｔｕｒａ等［５］建立了１种简便的测定Ｒｈａｍｍｕｓｐｕｒｓｈｉａｎａ中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｇ１、Ｂ２、Ｇ２的ＬＣ－ＭＳ方
法。用甲醇－水混合物提取样品中的ＡＦ，然后用装有
聚合物吸附剂的固相萃取柱进行净化。净化液直接
进样，色谱系统装有Ｃ１８反相短柱，使用甲醇－水的
体积比３０︰７０作流动相；质谱系统是单级四极杆质
谱，带电喷雾电离源，使用阳离子模式。结果显示有
较好的重复性，ＡＦＢ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ１、ＡＦＧ２的回收率
分别为１００％、８９％、８１％、７７％。Ｓ／Ｎ＝３时检测限达１０ｎｇ，Ｓ／Ｎ＝１０时检测限为２５ｎｇ。２．２赭曲霉毒素的检测
赭曲霉毒素（ＯＴ）是赭色曲霉属和几种青霉属
真菌产生的一种毒素，包括Ａ、Ｂ、Ｃ等７种结构类似
的化合物，其中以ＯＴＡ毒性最大。赭色曲霉属产生ＯＴ的条件是中温、寒冷气候。一般容易感染ＯＴ的
食品包括大豆、绿豆、绿咖啡豆、啤酒、葡萄汁、调味
品及草本植物。ＯＴ对动物的肝脏和肾脏危害最大，
而且还有致畸性、免疫抑制和致癌性。欧盟国家对ＯＴＡ在食品中的限量标准极其严格，如：在谷物中
不得超过５μｇ／ｋｇ；在谷物制品中不得超过３μｇ／ｋｇ，
在干鲜果品中不得超过１０μｇ／ｋｇ［６，７］。Ｍｉｃｈａｅｌ等人［８］用ＬＣ－ＭＳ测定谷类制品中的Ｏ－ＴＡ。先对受试样品进行溶剂提取，提取液用免疫亲
和柱净化，然后上机进行分析检测。结果显示，检测
限为１５μｇ／ｋｇ，回收率为９０％。２．３展青霉毒素的检测
展青霉毒素（ＰＴＬ）又名棒曲霉毒素，可由多种
青霉及曲霉产生，它是１种神经毒素，有致畸性和致
癌性，主要污染水果、浆果、蔬菜、面包和肉类制品。ＰＴＬ能诱发肿瘤，并对消化系统和皮肤组织具有损
害作用［９］。Ｓｅｗｒａｍ等人［１０］用配备有选择性反应检测器（ＳＲＭ）的ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ来检测苹果汁中的ＰＴＬ。实验
条件如下：ＨＰＬＣ条件：流动相：乙腈－水的体积比１０︰９０，Ｃ１８反相柱（填充５μｍＯＤＳ－２），进样量２０μＬ，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，在ＭＳ检测之前先用ＵＶ在２７６ｎｍ进
行在线检测。ＭＳ条件：使用大气压化学电离－质谱（ＡＰＣＩ–ＭＳ），ＡＰＣＩ气化温度和质谱毛细管柱温分别为４５０
℃和１５０℃，离子流和柱压分别为５μＡ和７Ｖ或－４Ｖ（阳离子或阴离子）。质谱进行ｍ／ｚ１００￣ｍ／ｚ１６０
全扫描以观察质子化的（ｍ／ｚ１５５）或去质子化（ｍ／ｚ１５３）的分子离子。ＰＴＬ的检测是对去质子化的分子离子进行碰撞
诱导分裂（１５％碰撞能量），利用选择反应检测（ＳＲＭ）
通过ＭＳ－ＭＳ模式完成。ｍ／ｚ１３５、１２５和１０９的最终
离子用分离宽２ｕ检测，通过与标准品的峰面积比
较定量。当注射量在６￣２００ｎｇ范围时，ＰＴＬ和注射
量呈线性，使用阴离子效果较好。感染１０￣１３５μｇ／ＬＰＴＬ的苹果汁在用乙酸乙酯液液萃取和碳酸钠处理
后用反相ＨＰＬＣ分析，使用乙腈－水的体积比１０︰９０、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ，可以检测到１０μｇ／Ｌ，当信噪比（Ｓ／Ｎ）为４时，检测限为４μｇ／Ｌ。Ｔｈｏｍａｓ等［１１］使用ＨＰＬＣ－ＡＰＣＩ－ＭＳ来检测肉及
水果中的ＰＴＬ，回收率为８７％￣１１６％，检出限达到６ｎｇ／ｇ。２．４串珠镰刀菌毒素的检测
串珠镰刀菌毒素（ＭＦ）属剧毒物，有很强的心脏
毒性，中毒死亡后可见心肌坏死性病变，近年研究表
明该毒素可能是克山病主因。ＭＦ广泛污染粮食作
物，其中对玉米及玉米制品的污染率较高［１２］。Ｓｅｗｒａｍ等［１３］以三乙胺作为离子对试剂应用ＬＣ－ＭＳ测定镰刀菌毒素培养基中的ＭＦ与自然污染的
玉米中的ＭＦ。ＨＰＬＣ分析中使用ＳｐｅｃｔｒａＳｅｒｉｅｓＰ２０００泵并联
有ＡＳ１０００自动进样器，ＵＶ１０００可变波长紫外检
测器，１５０ｍｍ×２ｍｍＣ１８反相色谱柱（填充有５ｍＯＤＳ－２）。流动相：醋酸铵－甲醇－三乙胺的体积比９０︰１０︰０．１，ｐＨ８．２４，流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ。样品过０．４５μｍ微孔滤膜，进样量为２０μＬ。２２９ｎｍ为紫外
检测限。
负离子ＡＰＣＩ－ＭＳ中应用ＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＬＣＱ离
子阱质谱。直接以５μＬ／ｍｉｎ的流速将３０μｇ／ｍＬＭＦ
标样混入样品、混和进样以优化ＭＳ参数。ＡＰＣＩ气
化温度和质谱毛细管柱温为３５０℃和１５０℃。电流
保持在５μＡ，电压保持在８Ｖ。调整期间，质谱从ｍ／ｚ５０扫描至ｍ／ｚ１５０，之后的所有实验都是在ＳＩＭ
模式ｍ／ｚ９７监测去质子分子离子［Ｍ－Ｈ］－下完成的。５种南非产的Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｕｂｇｌｕｔｉｎａｎｓ菌株在玉
米颗粒上培养，用９５︰５的乙腈水溶液提取ＭＦ。过Ｃ１８反相固相萃取柱，萃取液上ＬＣ－ＭＳ分析。研究发
现ＭＦ的响应在进样量１０ｎｇ￣７００ｎｇ之间保持线９６
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性，检测限为１０ｎｇ，信噪比为４。ＭＦ的浓度范围在１３０ｍｇ／ｋｇ培养基到１４６０ｍｇ／ｋｇ培养基之间。将此
方法用于自然污染的玉米样品结果表明ＬＣ－ＭＳ能
够检测所选玉米中１０μｇ／ｋｇ的ＭＦ。２．５玉米赤霉烯酮的检测
玉米赤霉烯酮（ＺＥＡ）是真菌禾谷镰刀菌产生的
一种雌激素真菌毒素。它有１５种以上的衍生物，主
要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱和大
米中也有一定程度的分布。ＺＥＡ具有较强的生殖毒
性和致畸作用，毒性作用与甾醇激素（１７β－雌二醇）的
作用相似，可发生雌激素亢进症，导致不孕或流产［１４］。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等［１５］建立了１种用于检测食品和饲
料中ＺＥＡ的ＬＣ－ＭＳ方法。
其分析检测系统为ＨＰ１１００系列ＨＰＬＣ－ＭＳ。
由１个ＨＰＧ１３１３自动进样器，１个ＨＰＧ１３１１Ａ四
元泵，１个ＨＰＧ１３１６Ａ柱恒温装置（配置了１个柱
的开关阀），１个ＨＰＧ１３２２Ａ脱气装置以及１个ＨＰＧ１３１５Ａ二极管阵列紫外－可见光谱检测器，ＨＰ
Ｇ１９４６Ａ质谱检测器（装备了１个ＨＰＧ１９４７ＡＡＰＣＩ
接口）所组成。ＨＰＬＣ使用１个ＨｙｐｅｒｓｉｌＯＤＳ分析柱（１００ｍｍ×２．１ｍｍ，５μｍ），用于分离。加上Ｈｙ－
ｐｅｒｓｉｌＯＤＳ防护柱（２０ｍｍ×２．１ｍｍ，５μｍ）。ＺＥＡ提取方法：２５ｇ被ＺＥＡ污染的玉米＋１００
ｍＬ乙腈－水的体积比７５︰２５混合，搅匀，过滤后，
每２０ｍＬ滤液中加入８０ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ＝７．４），
然后通过免疫亲和柱进行纯化。
纯化的样品进样，进行分析检测。ＡＰＣＩ的参数
经过优化，使测定ＺＥＡ的灵敏度达到最好。结果表
明，使用ＡＰＣＩ－ＭＳ检测，要比使用ＨＰＬＣ荧光检测
的灵敏度高，ＺＥＡ的检测限达到了０．１２μｇ／ｋｇ玉米，
比现在的极限值要低。因为ＭＳ检测器的选择性，可
以直接分析样品，不需要纯化。只需要普通大小（１００ｍｍ）的色谱柱或者短一点的（２０ｍｍ）的就可以
了。经过纯化则可以减少可能的干扰。Ｐａｌｌａｒｏｎｉ等［１６］通过加压湿法萃取从小麦和玉米
中提取出ＺＥＡ，萃取液不经纯化直接进ＬＣ－ＭＳ进
行分析。使用统计方法来评价萃取中的各种参数，
如：温度、时间及溶剂配比等对结果的影响。结果显
示溶剂配比对ＺＥＡ的回收有强烈的影响，ＬＣ－ＭＳ
分析能对结果进行很好的量化。在选定的萃取条件
下（８０℃，５ｍｉｎ，两次萃取，溶剂：甲醇－乙腈），对样
品进行ＬＣ－ＭＳ分析，此样品已用国际上常用方法测
出结果。对比原方法的实验结果，新方法所测定的ＺＥＡ在小麦和玉米中的回收率分别为１１８％［相对标准偏差（ＲＳＤ）＝５．２％，ｎ＝３］和１０７％（ＲＳＤ＝２．２％，ｎ＝３），说明此新方法具有较高的可靠性。
近年来，国外使用ＬＣ－ＭＳ来检测食品中ＺＥＡ
的例子还有很多，比如：Ｌｅａ等［１７］对小麦提取液不经
纯化，直接使用ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ来检测其中的ＺＥＡ，
结果显示，回收率１０７％，检出限１２ｎｇ／ｇ。而Ｆｒａｎｚ
等［１８］先用多功能净化柱对玉米提取液进行纯化，然
后使用ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＳ来检测其中的ＺＥＡ、ＤＯＮ等，
最终，回收率在５０％￣９９％，检出限达到２￣３０ｎｇ／ｇ。２．６脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）是Ｆ．镰刀菌霉（主
要是Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍｈ和Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）的二级代谢产
物。这类真菌大多在低温、潮湿和收割季节时在谷物
庄稼中慢慢生长。从化学性质上看，ＤＯＮ是单端孢
霉烯族化合物中的１种，亦称呕吐毒素（Ｖｏｍｉｎｔｏｘ－ｉｎ）。它一般在大麦、小麦、玉米及燕麦中有较高的
浓度。已证明，发霉玉米中的ＤＯＮ对猪会产生毒性，
对人会产生食物中毒性白细胞缺乏症。故大多数国
家一般要求动物饲料中的ＤＯＮ不得超过２ｍｇ／ｋｇ，
而人类消费品中的含量不得超过１ｍｇ／ｋｇ［１９］。Ｒａｚｚａｚｉ－Ｆａｚｅｌｉ等［２０］为检测Ｂ类单端孢酶烯主
要化合物及ＤＯＮ的主要代谢产物，建立了１种基于
高效液相色谱、大气压化学电离质谱联用的选择性
分析方法，可同时检测分析镰刀菌烯醇（ｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＮＩＶ）、脱氧镰刀菌烯醇（ＤＯＮ）、５－乙基脱氧镰刀菌烯
醇（５－ａｃｅｔｙｌｄｅｘｏｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，１５－ＡｃＤＯＮ）、３－乙基脱氧
镰刀菌烯醇（３－ａｃｅｔｙｌｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，３－ＡｃＤＯＮ）、醋
酸镰刀菌烯醇（ｆｕｓａｒｅｎｏｎＸ，Ｆｕｓ－Ｘ）、脱氧环脱氧雪腐
镰刀菌烯醇（ｄｅ－ｅｐｏｘｙｌｄｅｘｏｙｌｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＤＯＭ－１）。处理
后的样品上机检测，使用地塞米松（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｄｅｘ）为内标。
色谱条件：Ｗａｔｅｒｓ６２６－ＬＣ泵和Ｗａｔｅｒｓ７１７自动
进样器，分离柱为Ｓｙｎｅｒｇｉ４ｍｐｏｌａｒ－ＲＰ８０Ａ分析柱（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ，４μｍ）。柱温：３０℃。流动相组成
程序变化：开始：水－乙腈－甲醇的体积比为８２︰９︰９，；２５ｍｉｎ后为水－乙腈－甲醇的体积比为４０︰６０︰０；最后回到水－乙腈－甲醇的体积比为８２︰９︰９，保
持５ｍｉｎ，流速：１ｍＬ／ｍｉｎ。
质谱条件：ＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ质谱仪，带Ｐｅｐｐｅｒｐｏｔｃｏｕｎｔｅｒ电极的ＡＰＣＩ接口。扫描范围：ｍ／ｚ１５０￣５００；
载气为氮气；离子源温度：１００℃；ＡＰＣＩ气化温度：４００℃；锥孔电压：２０Ｖ。
样品前处理，猪尿液处理：尿液４ｍＬ与２１ｍＬ
乙腈混合，离心１ｈ，过滤抽提液，滤液取１０ｍＬ转９７
