国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展
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玉米中的黄曲霉毒素及检测方法研究玉米是世界上主要的粮食作物之一,被广泛用于食物加工和饲料生产。
玉米中常常存在着一种有害的真菌毒素——黄曲霉毒素,对人畜健康构成潜在威胁。
对玉米中的黄曲霉毒素及其检测方法的研究成为了当前食品安全领域的热点之一。
一、黄曲霉毒素的来源及危害黄曲霉毒素是由黄曲霉属真菌产生的一类毒素,主要存在于玉米及其制品中。
当玉米长期存放在潮湿的环境中,就容易受到黄曲霉真菌的污染,产生黄曲霉毒素。
这些毒素对人和动物的健康都会带来危害,包括肝脏损伤、免疫毒性和致癌性等。
特别是对于婴幼儿和孕妇来说,摄入过量的黄曲霉毒素会对身体健康造成更大的影响。
二、玉米中黄曲霉毒素的检测方法1. 生物学检测方法生物学检测方法是通过利用黄曲霉毒素对细胞、组织或动物的毒性作用进行检测的一种方法。
目前常用的生物学检测方法包括小鼠生物法、鸡胚法等。
这些方法对黄曲霉毒素的检测比较敏感,但是需要使用动物进行实验,存在动物使用受到伦理规范的限制,而且操作复杂且耗时耗力。
2. 化学分析法化学分析法是目前最常用的黄曲霉毒素检测方法,主要包括高效液相色谱法(HPLC)和液质联用技术(LC-MS)。
这些方法可以对玉米中的黄曲霉毒素进行快速、灵敏的检测,但是仪器昂贵,维护成本高,需要专业的操作人员进行操作。
3. 免疫学检测法免疫学检测法是通过检测黄曲霉毒素与特异性抗体的结合来进行检测的一种方法。
包括酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫荧光法(IFA)等。
这些方法具有操作简便、快速、灵敏度高的优点,是目前较为常用的检测方法。
三、玉米中黄曲霉毒素检测方法的研究进展随着科学技术的不断进步,玉米中黄曲霉毒素检测方法也在不断完善和更新。
近年来,研究人员在检测方法的选择、检测灵敏度和准确性等方面进行了大量的工作,取得了一系列的研究成果。
1. 检测方法的选择研究人员对各种不同的检测方法进行了比较,发现免疫学检测法具有操作简便、快速、灵敏度高的优点,逐渐成为了玉米中黄曲霉毒素检测的主流方法。
黄曲霉毒素的研究进展黄曲霉毒素(Aflatoxins,简称AFT) , 是20 世纪60年代初发现的一种真菌的有毒代谢产物, 由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生, 迄今为止, 已经发现B1、B2、B2a、G1、G2、M1、M2、Q1、Q2a 等17 种, 其结构特征为都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。
黄曲霉作为贮藏菌广泛分布于自然界中, 寄生曲霉在我国比较罕见, 它是以寄生方式存在于热带和亚热带地区甘蔗或葡萄上的一种害虫——水蜡虫体内。
在自然界, 黄霉的生长要求不高,在有氧条件下, 花生和玉米是最好的繁殖场所,这可能与其富含微量元素锌及能够刺激黄曲霉繁殖的生长因子有关; 在25~30 ℃下, 容易产生AFT。
AFT 是迄今发现毒性最强的一类生物毒素,已经在食油料作物的种子、干果、调味品、发酵产品和饲料内, 甚至在一些酒类等多种农产品及制品中发现。
AFT 是种肝脏毒素, 同时致癌。
1993 年,AFT 被世界卫生组织(WHO) 的癌症研究机构划定一类致癌物, 是一种毒性极强的剧毒素物质.1 黄曲霉毒素B1 和M1 的研究进展1.1 黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素B1(AFTB1) 是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物, 即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮( 香豆素) , 前者为基本毒性结构, 后者与致癌有关[2]。
国内最早研究真菌毒素免疫检测方法是中国医学科学院肿瘤研究所的孙宗棠, 他于1983 年建立了AFTB1 单克隆抗体放射免疫测定方法李永镛和殷芬、俞顺章等(1992)合作建立了AFTB1 单克隆抗体的酶联免疫检测方法。
中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所和江苏微生物所也先后建立了AFTB1 多克隆抗体的酶联免疫测定方法。
路戈、王德斌和计融等(1994)合作建立了规范的AFTB1 单克隆抗体酶联免疫检测方法, 该法已列为国家标准(GB/T5009.22—1996)。
在1985 年以前, 另有几种荧光色谱法列为国家标准(GB/T5009.23—1996;GB/T5009.24—1996), 其中薄层色谱法由卫生研究所和青商品检验局于1973年建(GB/T5009.22—1996)。
不同纳米材料的侧流免疫层析技术在真菌毒素检测中的应用1引言侧流免疫层析检测技术(LFIA)也称横向流动免疫检测技术,是出现于20世纪60年代初期的一种独特的免疫分析方式,以条状纤维层析材料为固相,借助毛细管的吸附作用使样品在层析材料上移动,其中样品中的待测物与层析材料上一定区域的抗体结合,通过酶促显色反应或直接使用着色标记物短时间获得直观的测试结果。
1990年,Begg、等最先将其用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定,随后该技术逐渐在环境监控、食品安全临床诊断等领域得到广泛应用,同时该技术也用于动物用药、农药残留霉菌毒素等污染物以及核酸、蛋白等生物大分子的检测领域。
真菌毒素(Mycotoxins)是由真菌产生的次级代谢产物,主要包括黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs) ,脱氧雪腐镰刀菌烯醇( Deoxynivalenol,DON ) ,储曲霉毒素A ( OchratoxinA ,OTA )、玉米赤霉烯酮( Zearalenone ,ZEN )、伏马毒素(Fumonisins , FBs)等,对人和动物的毒性主要有致癌、致畸、致突变、肝细胞毒性、中毒性肾损害、免疫抑制和生殖紊乱等。
这些真菌毒素会污染农作物,植物及其副产品等,进而给人类和家畜健康带来威肋、。
世界各国对农产品、食品和饲料中的真菌毒素的含量做出了严格规定。
目前,最常见的真菌毒素测定方法有仪器分析法和免疫分析法等。
常用仪器分析法主要有高效液相色谱法(HPLC)和色谱领谱法。
仪器分析法作为常规真菌毒素检测方法,因其灵敏度高,结果准确可靠而受到检测机构的青睐,其缺点是:需要对样品进行较为繁琐的预处理;需要具有专业实验技能的人员操作;仪器昂贵精密,且所用仪器的检测费用和维修费用昂贵,无法满足批量样品的快速筛查检测。
随着特异性抗体技术的发展,免疫相关方法得以迅速发展,逐渐成为毒素检测的新趋势。
侧流层析免疫检测技术具有简便、快速、灵敏、经济等优点,特别适合于大批量样本的检测。
2014年第2期摘要:食用油是生活中必不可少的食品,而油料作物和食用油中含有的真菌毒素会对人体造成损害,主要表现为细胞癌变、毒性遗传,突变畸形等,还会引起一系列肝肾中毒、生殖系统表现异常以及抑制免疫系统等反应。
从真菌毒素在油料及食用油中的来源、危害、现状、检测及防治方法进行综合论述。
关键词:食用油;真菌毒素;危害;防治中图分类号:S133 文献标志码:A doi:10.3969/jissn.1671-9646(X).2014.02.045(Institute of Agro-food Science and Technology,Shandong Academy of Agriculture Science,Ji'nan,Shandong 250100,China)Food oil is one kind food which is essential to daily life. Mycotoxins contained in oil crops and food oils is harmful to our human body,which represents to carcinogenicity,genotoxicity,teratogenicity,and also causing nephrotoxicity,liver toxicity,reproductive abnormalities and immunosuppressive reactions. This article describes from the mycotoxins in oilseeds and food oil,the hazards,the status quo,the detection method and the control methods to comprehensive exposition.food oil;mycotoxins;hazards;control methods收稿日期:2013-11-20作者简介:马治良(1988—),男,硕士,研究方向为粮油加工。
江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.)ꎬ2021ꎬ37(3):789 ̄799http://jsnyxb.jaas.ac.cn孙统政ꎬ王㊀娜ꎬ田㊀俊ꎬ等.黄曲霉毒素B1检测与脱毒方法最新研究进展[J].江苏农业学报ꎬ2021ꎬ37(3):789 ̄799.doi:10.3969/j.issn.1000 ̄4440.2021.03.031黄曲霉毒素B1检测与脱毒方法最新研究进展孙统政ꎬ㊀王㊀娜ꎬ㊀田㊀俊ꎬ㊀杨坤龙(江苏师范大学生命科学学院ꎬ江苏徐州221116)收稿日期:2020 ̄08 ̄28基金项目:国家自然科学基金项目(31900036)ꎻ江苏省自然科学基金项目(BK20190994)ꎻ江苏省高等学校自然科学研究面上项目(19KJB180016)ꎻ江苏师范大学自然科学研究基金项目(18XLRX029)作者简介:孙统政(1999-)ꎬ男ꎬ江苏徐州人ꎬ本科生ꎬ主要从事病原真菌黄曲霉菌的形态发生㊁次级代谢产物合成和致病调控分子机制研究ꎮ(E ̄mail)1756648259@qq.comꎮ王娜为共同第一作者ꎮ通讯作者:杨坤龙ꎬ(E ̄mail)ykl_long@yeah.net㊀㊀摘要:㊀食品和谷物中的黄曲霉毒素污染在全球范围内造成了严重的经济和健康问题ꎮ黄曲霉毒素B1(AFB1)具有极强的致突变性和毒性ꎬ并且对人类和牲畜均具有强致癌性ꎮ有关毒素的脱毒技术一直是国内外的一个研究热点ꎬ其中物理法㊁化学法和生物法脱毒是主要的脱毒方法ꎮ本文结合最新的研究成果ꎬ详细介绍了黄曲霉毒素B1的毒性及主要的检测方法ꎬ对黄曲霉毒素物理㊁化学㊁生物脱毒方法进行了概述ꎮ关键词:㊀黄曲霉毒素B1ꎻ检测方法ꎻ脱毒方法中图分类号:㊀TS201.3㊀㊀㊀文献标识码:㊀A㊀㊀㊀文章编号:㊀1000 ̄4440(2021)03 ̄0789 ̄11ResearchprogressofaflatoxinB1detectionanddetoxificationmethodsSUNTong ̄zhengꎬ㊀WANGNaꎬ㊀TIANJunꎬ㊀YANGKun ̄long(SchoolofLifeSciencesꎬJiangsuNormalUniversityꎬXuzhou221116ꎬChina)㊀㊀Abstract:㊀Aflatoxincontaminationinfoodsandgrainsposesseriouseconomicandhealthproblemsworldwide.Afla ̄toxinB1(AFB1)isextremelymutagenicandtoxicꎬandishighlycarcinogenictohumansandlivestock.Thedetoxificationtechnologyfortoxinshasalwaysbeenaresearchhotspotathomeandabroad.Amongthemꎬphysicalꎬchemicalandbiologi ̄caldetoxificationaremaindetoxificationmethods.BasedonthelatestresearchresultsꎬthisarticleintroducedthetoxicityandmaindetectionmethodsofaflatoxinB1indetailandsummarizedphysicalꎬchemicalandbiologicaldetoxificationmeth ̄odsforaflatoxin.Keywords:㊀aflatoxinB1ꎻdetectionmethodꎻdetoxificationmethod㊀㊀黄曲霉菌(Aspergillusflauvs)是一种世界范围常见的许多重要农作物以及动物的共同致病菌ꎮ黄曲霉菌产生的次级代谢产物黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前发现毒性和致癌性最强的天然化合物之一[1]ꎮ黄曲霉菌能够感染许多重要的农作物ꎬ例如ꎬ花生㊁玉米㊁棉花等ꎬ均可对收获前后的农作物进行污染ꎬ给世界各地的农业生产造成巨大的经济损失ꎮ根据联合国粮农组织统计ꎬ每年约有25%的谷物被真菌毒素污染ꎬ其中最主要的就是黄曲霉毒素ꎬ给农业造成了巨大经济损失[2]ꎮ中国同样是黄曲霉毒素污染的重灾区ꎬ多个省份储存的玉米和花生中都检测到了黄曲霉毒素的污染[3 ̄4]ꎬ此外ꎬ在多个抽样的酱油以及水产饲料等加工产品中都检出AFB1[5 ̄6]ꎮ由于黄曲霉毒素B1具有较稳定的理化性质ꎬ很难被降解ꎬ一旦污染的饲料被禽畜食用ꎬAFB1将在动物体内经羟基化代谢形成和AFB1毒性和致癌性基本相似的衍生物AFM1ꎬ一部分的AFB1的衍生物会随尿液和乳汁排出ꎬ而很大一部分会出现在奶制品和肉制品中ꎮ黄曲霉毒素具有较强的毒性㊁诱变性及致癌987性[7]ꎮAFB1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物ꎬ含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮[8]ꎬ见图1ꎮAFB1结构中存在3个毒性位点:①呋喃环上的8㊁9位双键ꎬ是毒素与蛋白质和核酸形成复合物的作用位点ꎬ为基因突变以及致癌致畸的主要功能基团ꎻ②内酯环部分的10㊁11㊁15号位点ꎬ易受到水解作用ꎬ因此是较活跃的毒素降解位点ꎻ③环戊烯酮环上的1㊁2㊁3㊁14号位ꎬ该位点易被取代基团取代ꎬ从而也决定了黄曲霉毒素的毒性ꎮ黄曲霉毒素的污染给农牧业生产带来重大的经济损失ꎬ并严重危害人类健康和食品安全ꎬ目前世界卫生组织已将其认定为1A类致癌物ꎬ2017年中国农业农村部也将农产品中黄曲霉毒素的控制技术作为农业主推技术之一ꎮ因此ꎬ研究AFB1的脱毒技术变得尤为重要ꎮ图1㊀黄曲霉毒素B1的化学结构Fig.1㊀ChemicalstructureofaflatoxinB11㊀黄曲霉毒素B1毒性概述1.1㊀AFB1对人类和动物的毒性作用AFB1对人类和几种动物有剧毒ꎬ并具有3个主要特征:亲有机性㊁遗传毒性和致癌性ꎮ它主要对有机体的肝脏亲和并产生损害ꎬ例如肝出血和肝细胞坏死[9]ꎮ遗传毒性主要是诱导AFB1 ̄DNA加合物的形成和代谢形成ABF1环氧化物(ABFO)引起p53基因的热点突变ꎮ虽然部分AFBO会在谷氨酰胺转移酶作用下生成AFB1谷胱氨肽结合物或生成AFB1二氢二醇进一步在醛还原酶作用下生成AFB1二羟醇经肾脏排泄出机体ꎬ但是剩下的大部分AFB1仍然会损害机体ꎬ例如诱导DNA损伤进而引起肝细胞癌变[7]ꎮ临床调查发现ꎬAFB1是乙型肝炎病毒感染患者患肝癌的主要原因ꎮ它是一种遗传毒性肝癌ꎬAFB1通过诱导形成DNA加合物引起癌症ꎬ从而导致靶细胞发生遗传变化ꎬ诱导DNA链断裂和DNA碱基损伤ꎮ氧化损伤最终会导致癌症ꎮAFB1主要通过肝脏代谢ꎬ从食物中摄取的AFB1主要通过细胞色素P450酶代谢为最终致癌物AFB1 ̄8 ̄9 ̄环氧化合物(AFBO)ꎮ当AFBO与DNA反应时ꎬ它通过与鸟嘌呤碱基相互作用而抑制p53(外显子249的热点编码区)中的基因突变ꎬ这可能会导致肝细胞癌变ꎮAFB1通过P450系统代谢为许多羟基化产物ꎬ包括AFM1㊁AFQ1㊁AFP1㊁AFB2a[7]ꎮ黄曲霉毒素被摄入人体后ꎬ主要的中毒表现为急性中毒和慢性中毒ꎬ急性中毒发作通常由于高浓度的黄曲霉毒素摄入ꎮAFB1在人体中的转化途径如图2所示ꎮ1.2㊀AFB1对儿童生长发育的影响生长障碍或发育迟缓是一个重大的公共卫生问题ꎬ影响到全世界数以百万计的儿童ꎬ特别是在发展中国家ꎮ一项对125名肯尼亚孕妇的调查结果表明ꎬ有53%的孕妇血液中黄曲霉毒素生物标志物为阳性ꎬ而脐带血中标志物阳性率为37%ꎬ研究还发现黄曲霉毒素阳性的孕妇生产的新生儿体质量明显降低ꎬ另外ꎬ研究期间发生的2个死胎仅来自AFB1阳性孕妇[10]ꎮGong等[11]发现研究地区的479名儿童中有99%的儿童为AFB1 ̄白蛋白阳性ꎬ断奶后儿童阳性水平更高ꎬ此外ꎬ发育不良的儿童的AFB1 ̄白蛋白水平与身高和体质量之间呈显著负相关ꎬ断奶的儿童中AFB1 ̄白蛋白水平高于仍在接受母乳的孩子(断奶后饮食主要以玉米为主)ꎬAFB1 ̄白蛋白水平较高的儿童身高平均下降了1 7cmꎮ这些研究结果表明ꎬ胎儿和新生儿暴露于AFB1会对身体生长有显著影响ꎬ尤其在断奶后阶段ꎮ1.3㊀免疫抑制动物中的研究结果显示AFB1具有诱导免疫抑制的作用ꎮ例如ꎬ在暴露于AFB1的动物模型中发现ꎬB细胞和T细胞的活性降低了ꎬT细胞对AFB1毒性更敏感[12]ꎮ在黄曲霉菌引起的曲霉病中ꎬ鸡的吞噬细胞受到严重破坏ꎬ从循环中清除异物的能力下降ꎬ这可能会降低加工抗原成分的能力[13]ꎮ同样在暴露于AFB1的猪体内ꎬAFB1会降低淋巴细胞对有丝分裂原的反应ꎬ抑制大噬菌体迁移并延迟皮肤过敏反应[13]ꎮ尽管从动物研究中获得了许多有关AFB1影响免疫作用的数据ꎬ但是关于长期食用被097江苏农业学报㊀2021年第37卷第3期图2㊀黄曲霉毒素B1的生物转移途径Fig.2㊀BiotransformationpathwaysofaflatoxinB1AFB1污染的食物对人体免疫系统影响的数据很少ꎮ冈比亚儿童唾液中sIgA水平降低ꎬ可能是由于饮食中黄曲霉毒素的暴露水平较高[14]ꎮ在对64位加纳人的研究中ꎬ发现AFB1暴露可能导致淋巴细胞亚群的主要成分T细胞和B细胞减少ꎬ与低水平的AFB1白蛋白加合物相比ꎬ高水平的AFB1白蛋白加合物能显著降低CD8+细胞毒性T细胞中穿孔素和颗粒酶a水平[15]ꎮ在AFB1水平高的受试者中ꎬ这些免疫参数的改变可能导致细胞免疫功能受损ꎬ从而降低宿主对感染的抵抗力ꎮ2㊀黄曲霉毒素B1检测方法高效液相色谱法㊁薄层色谱法和液相色谱质谱法是过去几十年测定AFB1含量的常规分析方法[16]ꎬ这些分析方法具有很高的灵敏度和良好的重复性ꎬ但样品处理繁琐ꎬ需要昂贵的仪器和专业人员ꎬ很大程度上限制了其在AFB1快速检测和现场筛选中的应用[17]ꎮ近年来以适配体和新型纳米材料为基础的检测传感器因具备灵敏度高㊁检出限低㊁成本低和操作简单等优势ꎬ在AFB1等毒素检测中得到了广泛应用ꎮ此外ꎬ目前也开发出通过引入基于适配子的不同技术ꎬ例如电化学[18]㊁表面等离子体共振[19]和比色法[20]来检测AFB1ꎮ2.1㊀双真菌毒素比色生物传感器比色生物传感器基于浓度信息转换为颜色变化的比色ꎬ可用肉眼进行分辨而达到检测目的ꎬ具有低成本㊁便携性㊁易操作性等优点ꎬ已广泛应用于霉菌毒素检测ꎮ目前比色测定多集中应用在单一霉菌毒素的检测[21]ꎬ关于同时检测多种霉菌毒素的报道较少ꎮZhu等[22]开发了一种同时检测双霉菌毒素的生物传感器ꎬ首次实现了针对AFB1和赭曲霉毒素(OTA)2种霉菌毒素的双重目标检测ꎮ该双霉菌毒素检测的工作原理为:将Fe3O4/GO和TP ̄GO(TP为百里酚酞ꎬGO为氧化石墨烯)分别与不同的AFB1的半互补链结合ꎬ然后加入AFB1适体并组装形成AFB1检测复合体(图3A)ꎻ同样ꎬFe3O4@Au和AuNPs(金纳米颗粒)也与OTA的半互补链和适体结合形成OTA检测复合体(图3B)ꎻ当AFB1和OTA存在时ꎬ因适体和靶标之间的亲和力强于半互补链ꎬ两个检测复合体都将解离ꎬ磁超螺旋离心分离后ꎬ提取上清液进行反应ꎬ并根据相应溶液在不同pH值下的颜色变化确定AFB1和OTA的量(图3C)ꎮ由于反应条件的不同ꎬ两种传感方法互不干扰ꎬ甚至可以提供更高的检测效率ꎮ双真菌毒素比色生物传感器具有良好的检测性能ꎬ线性范围为AFB15~250ng/ml和OTA0.5~80 0ng/mlꎬ具有良好的重现性和选择性ꎬ在微生物和环境领域具有广阔的应用前景ꎮ2.2㊀刺激响应型水凝胶生物传感器由于适配体具有稳定性好㊁便携性㊁易于存储和高特异性等特点ꎬDNA/适体交联的DNA聚合物杂197孙统政等:黄曲霉毒素B1检测与脱毒方法最新研究进展A:TP ̄DNA1 ̄GO ̄AFB1适体 ̄DNA2 ̄Fe3O4/GO的组装ꎻB:AuNPs ̄OTA适体 ̄Fe3O4@Au ̄COTA适体纳米颗粒组装ꎮ图片参考自文献[22]ꎮ图3㊀基于比色生物传感器的黄曲霉素B1(AFB1)和赭曲霉毒素(OTA)检测的工作原理Fig.3㊀WorkingprincipleforaflatoxinB1(AFB1)andochratoxin(OTA)detectionbasedoncolorimetricbiosensor化刺激响应水凝胶引起了广泛的关注[23]ꎮTang等[24]在一项研究中ꎬ设计了一种简单的AFB1检测方法ꎬ结合了基于适体的靶标刺激反应水凝胶系统的多功能性以及使用电子天平作为读数的便利性ꎬ以线性透明质酸接枝的单链DNA复合物作为主链ꎬAFB1适体和聚乙烯亚胺作为交联剂ꎬ构建了AFB1靶标响应性双交联水凝胶ꎮ铂纳米颗粒(PtNPs)首先被嵌入水凝胶中ꎬAFB1的存在可以提高亲和力与适体结合ꎬ并导致适体从水凝胶中释放ꎮ通过添加DNA外切酶I(ExoI)可特异性识别并切割AFB1中的适体 ̄适体复合物ꎬ导致AFB1释放ꎻAFB1再次与水凝胶反应ꎬ导致水凝胶适体再次释放ꎬ从而实现目标循环ꎮ通过这种方式ꎬ水凝胶将崩溃ꎬ并使大量的PtNP释放ꎮ释放的PtNP与排水装置中的H2O2反应ꎬ在内部和外部之间产生压力差ꎬ从而排出水ꎬ并且水的质量可以通过简单的电子天平准确称量ꎮ该方法已用于花生样品中AFB1的检测[24]ꎬ在新鲜花生样品中未检测到AFB1ꎬ但在发霉的花生样品中检测到约33 16μg/kgAFB1ꎬAFB1的回收率在91 5%至98 1%之间ꎬ结果与AFB1酶联免疫分297江苏农业学报㊀2021年第37卷第3期析试剂盒的检测结果[92 8%至97 7%(LOD:1μg/kg)]基本一致ꎬ证明了使用该传感器检测食品样品中AFB1的可行性ꎮ2.3㊀新型荧光适配体传感器近年来ꎬ金纳米星(AuNSs)因具有特殊的多支化纳米结构ꎬ且有一个易于修饰和固定材料的中心核ꎬ应用范围广泛ꎮZheng等[18]成功地开发了一种新型的适体传感器ꎬ用于基于量子点和AuNSs的荧光定量猝灭剂纳米和智能手机光谱读取器的多农药实时定量ꎮWei等[25]以AuNSs作为荧光猝灭材料ꎬ制造了用于AFB1检测的简单新颖的FRET系统ꎮ由于适体的荧光标记会影响适体与其靶标的结合亲和力[25 ̄26]ꎬ因此ꎬ将合成羧基荧光素(FAM)标记的具有发夹结构的互补DNA设计为信号探针ꎮAuN ̄Ss不仅固定了大量的信号探针ꎬ而且由于其特殊的结构和出色的光学性能ꎬ还可以用作淬灭材料ꎮFAM标记的发夹结构(HP)与AFB1杂交适体形成双链DNAꎬ发夹结构被打开ꎮ当通过Bio ̄SA特异性结合在AuNSs的表面修饰双链DNA时ꎬFAM离AuNSs很远ꎬ导致淬灭效率低和荧光强度强ꎮ当AFB1存在时ꎬAFB1优先结合适体ꎬ导致双链DNA的崩解ꎮFAM标记的HP恢复发夹结构ꎬ使FAM接近AuNSsꎬ并降低荧光强度(图4)ꎮ新型荧光适配体传感器对玉米样品中AFB1的最低检出限为21 3pg/mlꎬ证明新型荧光适配体传感器的AFB1检测试验获得满意结果ꎬ并且在存在其他高浓度毒素的情况下也表现出良好的选择性ꎮ图片参考自文献[25]ꎮ图4㊀基于金纳米星/羧荧光素标记发夹/适体的AFB1荧光检测示意图Fig.4㊀SchematicdiagramforfluorescentdetectionofAFB1basedonAuNSs/carboxyfluorescein ̄labeledhairpin/aptamer3㊀黄曲霉毒素B1脱毒方法由于食品中黄曲霉毒素的污染对人类健康构成威胁ꎬ并造成严重的经济损失ꎬ因此开发高效㊁安全的AFB1脱毒方法具有重要意义ꎮ目前对真菌毒素的脱毒主要有2种策略:(1)防止霉菌污染和生长ꎻ(2)污染产品脱毒ꎮ常用的脱毒方法包括物理方法㊁化学方法和生物方法ꎮ3.1㊀物理方法3.1.1㊀加热脱毒㊀从食品中去除AFB1的物理方法最常见的是加热ꎮ众所周知ꎬ黄曲霉毒素在高温下稳定ꎬ因此需要苛刻的加热才能有效地去除黄曲霉毒素ꎮ最近的研究结果表明ꎬ在150~200ħ的温度下可以去除大量的AFB1(平均降低79%)ꎬ同时在高湿度下最为有效[27 ̄28]ꎮ该方法的问题是在加热和烘烤完成之后难以确保产品的完整性ꎬ从而会限制可以使用的最高温度ꎬ可能仅导致部分的AFB1分解ꎮ然而ꎬ该技术可以容易地以低成本实施ꎬ并且可以在2h或更短时间内实施ꎬ从而具有物流优势ꎮ3.1.2㊀γ射线脱毒㊀另一种最常用的物理净化方法是γ射线脱毒ꎬ可用于花生㊁谷物和动物饲料等多种食品基质ꎮ该技术为用γ射线源(例如60Co)辐照食品ꎬ直到获得一定量的电离辐射为止ꎬ电离辐射的范围为6~60kGyꎮAFB1含量平均降低65%[29]ꎮ使用强辐射存397孙统政等:黄曲霉毒素B1检测与脱毒方法最新研究进展在安全问题ꎬ可能使实施这项技术变得困难ꎮ3.1.3㊀吸附剂脱毒㊀在食品中添加吸附剂也可有效去除AFB1污染ꎮ此方法与降解方法不同ꎬ它不破坏㊁不减少食品中AFB1的量ꎮ吸附剂与AFB1结合可防止摄入后AFB1被肠道吸收ꎬ从而防止AFB1的肝毒性作用ꎮ(1)叶绿素对AFB1的吸附ꎮSimonich等[30]报道了在向受AFB1污染的饲料中添加叶绿素后ꎬ大鼠的AFB1 ̄DNA加合物减少了42%ꎬAFB1 ̄白蛋白减少了65%ꎬ肿瘤发生率降低了77%ꎮ一项使用人类志愿者的研究中也发现ꎬ叶绿素可将尿中AFM1水平降低28%ꎬ尿中AFB1水平降低41%[31]ꎮ这些数据表明ꎬ在高风险地区的饮食中添加吸附剂可能有助于减轻AFB1的毒性作用ꎮ(2)氧化磁性石墨烯(MGO)和磁性石墨烯(Mr ̄GO)的纳米材料对AFB1的吸附ꎮ磁性复合材料的孔径分布均匀ꎬ孔连通性好ꎬ表面积大ꎬ是吸附有机污染物的优秀吸附剂ꎮJi等[32]研究结果显示ꎬMGO和MrGO都能够在40min内移除AFB1ꎬ对于受污染的油样ꎬMGO将AFB1从16 1μg/L降低至2 2μg/Lꎬ去除率为86 33%ꎬ当吸附剂量为20mg/ml时最大去除率达到96 4%ꎮ磁性复合吸附剂在AFB1脱毒中的应用ꎬ可能为食用油工业开发新型复合吸附剂开辟一条新道路ꎮ(3)黏土对AFB1的吸附ꎮ与叶绿素相似ꎬ黏土可在消化道中结合AFB1并防止肠道吸收AFB1ꎮ钙蒙脱土(NovaSil)是目前被证明有效的吸附剂黏土ꎬ它可以显著减少AFB1生物标志物的毒性作用[33]ꎮAfriyie ̄Gyawu等进行了一项长期研究ꎬ发现在28周内给大鼠喂食NovaSil含量高达2 0%的饮食后ꎬ未观察到NovaSil具有明显的毒性[34]ꎮ此外ꎬ临床试验也证实ꎬNovaSil不仅能够明显降低参与者的尿AFM1和血清AFB1含量ꎬ而且具有较小的副作用[35]ꎮ这些结果表明ꎬ在饮食中添加NovaSil是降低AFB1毒性的安全有效方法ꎮ3.2 化学方法3.2.1㊀山梨酸钾㊁水合铝硅酸钠钙㊁L ̄蛋氨酸组合法㊀山梨酸钾(Sor)是一种有效的食品防腐剂ꎬ用于控制各种加工食品中霉菌的生长[36]ꎮ蛋氨酸(LM)是一种必需氨基酸ꎬ作为谷胱甘肽前体ꎬ可消除活性氧和DNA甲基化反应[37]ꎮ目前研究发现蛋氨酸有助于抗体的产生并改善血清中IgG水平[38]ꎮ因此ꎬ在AFB1污染的饮食中添加蛋氨酸可降低AFB1对动物的危害[39]ꎮ水合硅铝酸钠钙(Hsc)是一种化学吸附性物质ꎬ可以与AFB1形成稳定而牢固的复合物ꎬ以减少动物在消化和利用饲料过程中AFB1造成的不良影响ꎬ并且复合物还可以减弱AFB1对身体器官的毒性[40]ꎮReda等[41]发现在饲料中添加山梨酸钾(Sor)㊁水合铝硅酸钠钙(Hsc)和L ̄蛋氨酸(LM)的混合物能够有效提高兔抗AFB1毒性的能力ꎮ3.2.2㊀ClO2熏蒸法㊀二氧化氯(ClO2)是一种具有广泛且稳定的杀生物活性的强氧化剂和消毒剂ꎬ被用作水㊁水果和蔬菜的消毒剂ꎬ已经被联合国粮食及农业组织(FAO)分类为的食品添加剂ꎮClO2能够作用于AFB1毒性和致癌活性的关键活性位点 AFB1呋喃环的C8 ̄C9双键ꎮClO2将AFB1分解为4种物质:C17H13O8㊁C16H15O10㊁C17H15O10和C16H11O7ꎮ如图5所示ꎬ这4个降解产物的C8 ̄C9双键已被ClO2破坏ꎬ从而使经过修饰的AFB1降解产物的毒性大大降低甚至消失[42]ꎮYu等研究发现ꎬClO2气体可以抑制黄曲霉菌菌丝生长㊁孢子萌发和产生AFB1ꎮ随着ClO2浓度的增加ꎬAFB1的降解率也随之提高ꎬ而且AFB1的降解明显加快[42]ꎮ之前的研究者发现氯和次氯酸钠的氯化消毒剂能有效降解食品中的AFB1[43]ꎬ但是氯处理产生的化学残留物限制了其应用ꎬ并且作为液体消毒剂ꎬ次氯酸钠不适用于干物质(如谷物)脱毒ꎮ3.2.3㊀壳聚糖包被α ̄松油醇法㊀壳聚糖广泛用于包被生物材料ꎬ将某些化合物封装在壳聚糖纳米基质中可以增强其在保护食品中免受微生物污染的功效和稳定性ꎬ从而延长其货架寿命[44]ꎮα ̄松油醇是一种单萜醇ꎬ已在食品工业中广泛用作调味剂和熏蒸剂ꎬ用来保护食品免受微生物和昆虫的污染ꎮ此外它还具有广泛的药理特性ꎬ例如抗癌㊁抗炎和抗氧化[45]ꎮ将α ̄松油醇包被在壳聚糖中制成一种壳聚糖纳米乳液(α ̄TCsNe)ꎬ可用作新型抗真菌防腐剂增强α ̄松油醇的杀菌作用从而抑制AFB1的形成ꎮα ̄TCsNe的活性增强可能是由于α ̄松油醇的抗微生物活性与壳聚糖之间的协同作用所致ꎮ此外ꎬ纳米封装后的小粒径大表面积很容易穿透处理过的细胞ꎬ并干扰真菌细胞利用必需化合物ꎬ从而致其死亡[46]ꎮ该方法经济㊁方便㊁无毒㊁可控㊁无溶剂ꎬ这种方法对操作条件要求低ꎬ适用于亲水性和亲脂性化合物ꎬ用于配制稳定的纳米乳液[47]ꎮ497江苏农业学报㊀2021年第37卷第3期图片参考自文献[42]ꎮ图5㊀AFB1的4种降解产物结构Fig.5㊀StructureoffourdegradationproductsofAFB13.3㊀生物方法3.3.1㊀植物提取物降解㊀植物精油(EOs)具有显著的抗菌功效ꎬ因此作为健康危害性合成防腐剂的替代品具有巨大潜力ꎬ但其尚未被食品工业广泛使用ꎮ研究发现鸭嘴花和柠檬桉的提取物均有超过95%的AFB1降解率[48]ꎮYadav等[49 ̄50]发现0 3μl/ml壳聚糖包被的黑孜然精油可完全抑制黄曲霉菌生长和AFB1产生ꎬ壳聚糖包被的肉豆蔻精油在1 25μl/ml时便可以完全抑制AFB1产生ꎬ都具有很强的自由基清除活性ꎮPrakash等对马郁兰㊁芫荽㊁草果药㊁没药和香水树5种植物提取精油的抑菌㊁杀菌和对粮食的菌染防护率进行了研究ꎬ结果见表1[51]ꎮ表1㊀植物精油对黄曲霉产毒菌株的最低抑菌浓度㊁最低杀真菌浓度和对粮食的菌染防护率Table1㊀Minimuminhibitoryconcentrationꎬminimumfungicidalconcentrationofplantessentialoilagainsttoxin ̄produ ̄cingstrainsofAspergillusflavusandtheprotectionrateofgrainsagainstbacterialcontamination精油样品最小抑菌体积分数(μl/ml)最小杀菌体积分数(μl/ml)菌染防护率(%)香水树2.05.077.38芫荽3.0未知65.48草果药2.56.072.02马郁兰2.5-67.86没药3.07.055.363.3.2㊀益生菌抑制㊀利用微生物ꎬ特别是具有益生菌性质的微生物用于AFB1脱毒ꎬ是一种绿色高效㊁环保㊁廉价和安全的策略ꎮ不同类型的益生菌脱毒方式不同ꎬ有的将AFB1改造成其他无毒或低毒的次级产物或异构体ꎬ以达到消除食品和饲料中AFB1的目的ꎮ最新的益生菌脱毒研究成果如表2所示ꎮYang等[52]近期研究发现ꎬ利用米曲霉菌或者不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌突变体可以抑制黄曲霉菌的生长和毒素的合成ꎮXing等早期也运用黑曲霉菌来拮抗黄曲霉菌ꎬ从花生中分离到20株黑曲霉菌ꎬ20个黄曲霉毒素生物合成基因中有19个被黑曲霉菌下调[53]ꎮ因此ꎬ利用不产毒的黄曲霉菌或者安全的曲霉工业用菌可以有效地对产毒黄曲霉菌进行生物防治ꎬ可减少产毒黄曲霉菌对许多农产品的侵染及合成毒素ꎬ达到提前防控并减少经济损失的作用[54]ꎮ3.3.3㊀基因水平调控㊀基因水平调控是指在基因转录或翻译水平上ꎬ利用一些综合性方法处理黄曲霉菌ꎬ使黄曲霉菌的某些产毒基因被抑制甚至阻断或下调黄曲霉菌生命活动的必须基因ꎬ从而限制AFB1合成所必需的蛋白质㊁酶和化学物质的形成ꎬ甚至杀死黄曲霉菌ꎮ黄曲霉毒素合成基因簇如图6所示ꎮDhanamjayulu等[55]使用苯并咪唑及其衍生物下调黄曲霉菌的AFB1合成基因中的调控基因aflR597孙统政等:黄曲霉毒素B1检测与脱毒方法最新研究进展和结构基因aflB表达ꎬ有效抑制AFB1的生物合成ꎬ仅10μg/ml的质量浓度抑制效率便达到了98%ꎬ但是并不影响黄曲霉菌的正常生长ꎮCasquete等[56]利用pH㊁水分活度和温度对2个调节基因(aflR和aflS)和1个结构基因(aflP)表达的进行了研究ꎬ结果表明在pH5 5㊁水分活度0 95和20~25ħ时基因具有最高表达水平和AFB1积累量ꎮXing等[53]利用黑曲霉菌拮抗黄曲霉菌ꎬ发现aflS的表达显著下调ꎬ导致aflS/AflR比值降低ꎬ表明黑曲霉菌可通过降低aflS的丰度而直接抑制AFB1的生物合成ꎮ近期ꎬChen等[57]从Bacillusmegaterium中分离出的短肽L ̄Asp ̄L ̄Asn(DN)可以有效抑制黄曲霉菌的生长ꎮ表2㊀益生菌对黄曲霉毒素的生物脱毒Table2㊀Biologicaldetoxificationofprobioticstoaflatoxin益生菌㊀㊀㊀㊀㊀排毒机理最小杀菌体积分数(μl/ml)生物脱毒率(%)参考文献枯草芽孢杆菌UTBSP1降解未知90.2ʃ5.2[58]嗜酸链球菌CW117降解591.2[59]植物乳杆菌MON03结合5054.3ʃ7.3㊁82.3ʃ8.3㊁39.8ʃ0.4[60]植物乳杆菌C88结合257.6ꎻ59.4[61]克氏乳杆菌KFLM382%吸附182.0[62]啤酒酵母KFGY718%生物转化74.0糖醋杆菌KFGM165.0嗜酸乳杆菌结合50.0[63]短乳杆菌28.0鼠李糖乳杆菌2012结合183.5[64]植物唇形LOCK0862结合10065.0[65]短杆菌LOCK109360.0鼠李糖鼠李LOCK108759.0罗伊氏杆菌LOCK109659.0干酪杆菌LOCK091149.0链霉菌亚种AsoensisK234降解188.3[66]黄褐链霉菌K144rimosus95.6金丝链霉菌K14579.9地衣芽孢杆菌CFR1降解94.7ʃ1.1[67]图6㊀黄曲霉毒素合成基因簇Fig.6㊀Biosynthesisgeneclusterofaflatoxin4㊀结语黄曲霉毒素B1是目前发现毒性和致癌性最强的天然污染物之一ꎬ对人类和动物健康安全存在潜在威胁ꎮ因此对黄曲霉菌和黄曲霉毒素的研究也成为近几十年来国内外同行研究的热点ꎮ本文主要综697江苏农业学报㊀2021年第37卷第3期述了AFB1的毒性ꎬ以及近年来AFB1检测和脱毒方法ꎮ由于AFB1的低剂量㊁高毒特性ꎬ开发出更灵敏㊁更快速㊁更经济的检测手段是新的趋势和挑战ꎮ尽管目前已有多种AFB1脱毒方法ꎬ但是每种方法都有各自的优点和缺陷ꎬ很难做到既能保障脱毒食品的风味品质ꎬ又能确保食品安全ꎮ对于黄曲霉毒素的防范应早发现ꎬAFB1一旦进入后期的食品加工链ꎬ即使脱毒技术再成熟也会带来健康威胁ꎮ因此对黄曲霉毒素的早期检测以及消除其在农作物收获前后的污染对黄曲霉毒素的预防具有重要意义ꎮ参考文献:[1]㊀刘㊀畅ꎬ刘㊀阳ꎬ邢福国.黄曲霉毒素生物学脱毒方法研究进展[J].食品科技ꎬ2010ꎬ35(5):290 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产志贺毒素大肠埃希氏菌活菌检测方法的应用现状及展望王梓晨;牛洪梅;刘阳泰;王翔;董庆利
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2024(54)2
【摘要】产志贺毒素大肠埃希氏菌作为一种重要的食源性致病菌,会对人体健康造成严重威胁。
对其进行快速、准确的鉴定检测是预防和控制相关疾病的有效手段。
基于此,文章对目前可用于检测活体产志贺毒素大肠埃希氏菌的方法进行综述,主要包括传统的细胞培养方法、免疫学检测方法和分子生物学方法等,并对这些方法的应用和发展前景展开了深入探讨。
随着分子生物学和生物工程技术的发展,不同检测方法联合使用可以克服单一方法的缺陷,从而取得更高效、准确的检测结果。
【总页数】9页(P92-100)
【作者】王梓晨;牛洪梅;刘阳泰;王翔;董庆利
【作者单位】上海理工大学健康科学与工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
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4.食品卫生学——网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157:H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌
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《基于光谱及成像技术的小麦黄曲霉真菌毒素快速无损检测研究》一、引言随着粮食生产技术的不断发展,食品安全问题备受关注。
其中,粮食贮藏过程中的黄曲霉毒素污染问题尤为突出。
黄曲霉毒素是一种由黄曲霉等真菌产生的有毒代谢产物,对人类和动物的健康构成严重威胁。
因此,快速、无损的检测小麦中黄曲霉真菌毒素的技术研究具有重要意义。
本文将介绍一种基于光谱及成像技术的小麦黄曲霉真菌毒素快速无损检测方法,并探讨其相关应用和效果。
二、光谱及成像技术概述光谱技术是通过测量物质在不同波长下的辐射吸收、发射或散射等特性,来获取物质的成分、结构及状态信息的一种方法。
成像技术则是在光谱技术的基础上,通过捕捉物质表面的图像信息,实现对物质的三维可视化。
在小麦黄曲霉真菌毒素的检测中,光谱及成像技术可以快速获取样品的光谱特征和图像特征,为后续的检测分析提供依据。
三、基于光谱及成像技术的黄曲霉真菌毒素检测方法1. 样品准备:选取受黄曲霉污染的小麦样品,进行清洗、干燥和粉碎等处理,以便进行后续的检测分析。
2. 光谱数据采集:利用光谱仪对样品进行光谱扫描,获取样品的光谱数据。
3. 图像数据采集:利用成像设备对样品进行图像拍摄,获取样品的图像数据。
4. 特征提取:对光谱数据和图像数据进行处理和分析,提取出与黄曲霉真菌毒素含量相关的特征参数。
5. 模型建立:利用提取的特征参数建立预测模型,通过训练和优化模型,实现对小麦中黄曲霉真菌毒素的快速无损检测。
四、实验结果与分析1. 光谱特征分析:通过对受黄曲霉污染的小麦样品进行光谱扫描,发现不同浓度的黄曲霉真菌毒素在特定波长下的吸收峰存在差异。
这些差异可以作为区分不同浓度黄曲霉真菌毒素的依据。
2. 图像特征分析:通过对受黄曲霉污染的小麦样品进行图像拍摄,发现黄曲霉在小麦表面的分布情况和颜色等特征与未受污染的样品存在明显差异。
这些差异可以作为辅助判断小麦是否受黄曲霉污染的依据。
3. 模型预测性能:利用建立的预测模型对小麦样品进行黄曲霉真菌毒素含量的预测,发现模型的预测性能良好,能够快速准确地检测出小麦中的黄曲霉真菌毒素含量。
真菌毒素测试仪应用及校准方法的研究作者:周华文王光跃王晓红来源:《中国质量与标准导报》2022年第01期摘要:真菌毒素是指丝状真菌在粮食和饲料中生长产生的有毒次级代谢产物,极易污染各类农产品,对人体和动物危害极大;真菌毒素测试仪是一种快检仪器,可以对粮食存放产生的真菌毒素含量进行快速有效的测量,对食品、饲料安全检测初筛发挥着重要的作用;真菌毒素测试仪的量值准确性直接关系到粮食初筛的科学与否。
论文简单分析了真菌毒素测量的重要性和现阶段真菌毒素测试仪的校准状况;通过分析真菌毒素测试仪的各项技术指标,找出关键量值的评价方法,确定了真菌毒素测试仪的校准方法。
关键词:真菌毒素校准方法粮食安全Mycotoxin Tester Application and Research on Calibration MethodZhou Huawen1 , Wang Guangyue1,Wang Xiaohong2(1. Binzhou Inspection and Testing Center; 2. Shandong Yuntang Intelligent Technology Co.,LTD)Abstract: Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi growing in grain and feed. It is very easy to pollute all kinds of agricultural products,great harm to human body and animals. Mycotoxin tester is a fast detection instrument, which can quickly and effectively measure the content of mycotoxin produced by grain storage,and plays an important role in the preliminary screening of food and feed safety detection. The accuracy of mycotoxin tester is directly related to the qualification of primary screening of food and feed.This paper briefly analyzes the importance of mycotoxin measurement and the calibration of mycotoxin tester at present. By analyzing the technical indexes of mycotoxin tester, the evaluation method of key quantity value is found out,and the calibration method of mycotoxin tester is determined.Key words: mycotoxins, calibration method, food safety0 引言当前国家粮食供给处在紧平衡状态,疫情下粮食出口国停止出口,当下仓储粮的安全事关粮食安全的关键。