高效液相色谱法反相梯度洗脱萤光检测分析血浆氨基酸

高效液相色谱法反相梯度洗脱

萤光检测分析血浆氨基酸

刘华刘泽民朱无难

（上海第一医学院附属中山医院内科）

李毅弘王守栋蒋晓声

（上海合成树脂研究所二室）

〔提要〕本文报告了采用高效液相色谱法反相梯度洗脱，邻苯二甲醛和－巯基乙醇柱前衍生化，萤光检测分析血浆游离氨基酸。实验采用线性洗脱，在５分钟内可同时测定２２种氨基酸。血浆样品的预处理简单，衍生化反应的时间仅需１分３０秒，血＝浆样品的实际进样量少于１微升。本测定方法的精确度高，各个氨基酸保留时间的变异煜凳数均为０．３３％０．２６％（ＳＤ），峰面积的变异系数平均为１．７２％１．２５％（ＳＤ），各个氨基酸的浓度在󰀀１０３００毫微克／微升的范围中，线性关系的相关系数平均为０．９９６０．００７（ＳＤ）准确性亦好，各个氨基酸的回收率平均为９６．８％４．５％（ＳＤ）。实验中还比较和讨论了梯度型式和洗脱体积，不同固定相和色谱柱温度，流动相中缓冲溶液的ｐＨ值和离子浓度以及衍生化反应的时间和温度等因素对分析结果的影响。

长期以来氨基酸的测定通常使用氨基酸自动分析仪。此仪器采用离子交换色谱法分

离，用茚三酮柱后衍生再以紫外检测器测

定。此仪器的缺点是灵敏度受到一定限制，耗用试剂多，分析时间较长（１）。高效液相色

谱法是近年来崛起的分析技术，具有应用范

围广、分析速度快、分离效果好和灵敏度高

等优点，适合于分析生理体液中的多组分化学物质〔２〕场。邻苯二甲醛和β巯基乙醇可与氨

基酸起反应，形成可发生萤光的衍生物。这

一反应的萤光量子效率高，化学效应强，使用方便，且价格低廉３，４。因此我们摸索应用

高效液相色谱法反相梯度洗脱、邻苯二甲醛

和－巯基乙醇柱前衍生以及萤光检测分析血浆氨基酸，得到了理想的结果。实验中还比

较了梯度型式和洗脱体积，不同固定相和色谱柱温度，流动相中缓冲溶液的ｐＨ值和离

子浓度以及衍生化反应的时间和温度等因素对分析结果的影响。实验方法

（一）仪器高效液相色谱仪为西德Ｋｎａｕｅｒ公司产

品。萤光检测器的激发滤色片为ＵＧ－５，范围为２５０４００毫微米，发射滤色片为ＫＶ－

４０８截止于４００毫微米，平衡纪录仪（上海

大华仪表厂），ＣＤＭＣ－型色谱数据处理机（上海计算技术研究所）。色谱柱为Ｌｉ－

ｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ－１８等，５微米，２５０×４．６毫米

（内径）。

（二）试剂柠檬酸三钠、柠檬酸、冰醋酸、醋酸钠、

氢氧化钠、硼酸（均为ＡＲ级）。－巯基乙醇（ＢＤＨ），含量９９％。邻苯二甲醛（Ｆｌｕｋａ

ＡＧ）。甲醇（分析纯重蒸一次）。去离子二

次蒸馏水。氨基酸标准混合液（Ａｊｉｎｏｍｏｔ　Ｃｏ＇ｓ，

氨基酸标准参考品（ＢＤＨ

，Ｌ－谷氨酰胺（Ｌｉｇｈｔ），　Ｌ－门冬酰胺（北京化工厂），ＤＬ－瓜氨酸（ＢＤＨ，牛磺酸（上海试剂三厂）。

（三）溶液配制以１Ｍ的柠檬酸调节０．０３７５Ｍ的柠檬酸三

钠至ｐＨ７．０。以冰醋酸调节０．０１Ｍ的醋酸钠至ｐＨ７．０。以１Ｍ的氢氧化钠调节０．４Ｍ的硼

酸至ｐＨ１０．０。邻苯二甲醛４０毫克溶于０．５毫升甲醇，加巯基乙醇３０微升，然后用ｐＨ

为１０．０的硼酸缓冲液加至５毫升，配制成衍

生反应试剂。每一氨基酸各称取１０毫克，溶解于１００

毫升的甲醇与水溶液中（１：１，取出２毫升稀

释至５０毫升刻度。

（四）血浆样品的预处理血液以肝素作抗凝剂，抽血后以４０００

ｒｐｍ离心分离出血浆，取２０微升血浆加无水

乙醇６０微升沉淀血浆蛋白质，再以４０００ｒｐｍ离心１０分钟，取上清液４０微升测定游离氨基

酸含量。（五）实验操作梯度洗脱所用流动相溶剂“Ａ”为甲醇／

０．０１Ｍ醋酸钠缓冲液８０：２０（ｐＨ７．０）；溶剂“Ｂ”

为甲醇／０．０３７５Ｍ柠檬酸三钠缓冲液（２０：８０，ｐＨ７．０，使用前置于减压下超声脱气。线性梯度型式，溶剂“Ａ０％起至７０％止。梯

度时间４０分钟，流量１毫升／分钟。氨基酸

标准品或血浆样品上清液４０微升加衍生反应

试剂１００微升，反应时间１分３０秒，温度２５℃妫，

进样阀定量进样１０微升。萤光检测器的灵敏

度为１。

结果和讨论

（一）梯度洗脱梯度洗脱中起始甲醇

浓度不同对各个氨基酸容量因子的影响如图

１所示。从图中可见，起始甲醇浓度为２０％时分

离较好，如增多至３０％时，部分较早洗脱出

的组分不能分离或分离较差。这与Ｄｏｌａｎ等

的报道相符，流动相中有机溶剂起始浓度的

增加一般使分离受损失，但只影响较早洗脱出的组分〔５。故本实验选择的梯度起始甲醇

浓度为２０％。在梯度洗脱分析中，溶剂的变

化型式很重要，也是基本的实验因素。一般

应首先选用线性梯度型式。本实验用线性梯

度型式分析２２种氨基酸标准品混合液和正常

人血浆游离氨基酸的图谱见图２、图３。

与国外的同类实验比较，本实验的梯度型式较理想，不需用多元溶剂系统〔６８。在

梯度洗脱中，如其他色谱条件保持恒定，某

一组分的洗脱体积主要取决于体积流速Ｆ（毫升／分钟）和梯度时间（ｔｇ）９。本实验比

较了流量和梯度时间不同对色谱分析的影

响，流量从１毫升／分钟增加到１．５毫升／分

钟时，各氨基酸的容量因子减小，但精氨酸

与苏氨酸和甘氨酸的分离度同时变小。梯度时间为３０分钟时，除谷氨酰胺与组氨酸外，

其余氨基酸已能分离；梯度时间为４０分钟时，氨基酸标准品混合液中的

谷氨酰胺与组氨酸已能分

离；如延长梯度时间至５０

分钟，则血浆样品中的谷

氨酰胺与组氨酸也可良好

分离。因此本实验选择的流动相流量为１毫升／分

钟，梯度时间为４０或５０分

钟。在分析不同样品时，可根据需要选择适当的梯

度时间。（二）流动相流动相中缓冲溶液的

离子浓度对各氨基酸容量

因子的影响如图４所示

从图４可见，缓冲溶液的离子浓度在０．０１０．１ｍ的范围内，除瓜氨酸、精氨酸、

酪氨酸和丙氨酸外，其余氨基酸的洗脱秩序

无明显改变。与Ｌｉｎｄｒｏｔｈ等的分析结果比较〔７，除甘氨酸和苏氨酸的洗脱秩序先后不

同外，其他均一致。进一步的实验表明，用ＲＰ－１８色谱柱分析时，Ｂ溶剂缓冲溶液的浓度为０．０２５０．０５Ｍ时较好，故本实验选择Ｂ溶剂中的缓冲溶液的离子浓度为０．０３７５

Ｍ。流动相中缓冲溶液的ｐＨ值不同对各氨

基酸容量因子的影响不大，但我们发现流动

相中缓冲溶液的ｐＨ降低会使氨基酸衍生物

的萤光强度有不同程度的减弱，为保证较高

的检测灵敏度，我们选择流动相的缓冲溶液ｐＨ值为７．０。

（三）固定相

采用键合烷基链长度不同固定相的色谱柱分析时，各氨基酸容量因子的变化见图５。

相比之下，ＲＰ－１８色谱柱的分析效果较好，故为本实验所用。

将色谱柱恒定于不同温度比较实验结果，我们观察到色谱柱温度从１８℃升至４０℃

时，不但可缩短分析时间，而且可改善分离状

况，因此本实验将色谱柱温度恒定于４０。（四）衍生化反应

已有许多学者研究或总结了各种实验条

件对邻苯二甲醛及β巯基乙醇衍生化反应的影响〔１０，１１。与许多化合物一样，邻苯二甲

醛氨基酸衍生物在激发状态时所处的环境对

其萤光量子效率有很大影响。反应温度和时

间等因素常可影响激发能量的吸收和消耗。本实验考察了反应时间和温度不同对邻苯二

甲醛氨基酸衍生物萤光强度的影响。反应时

间的影响见表Ｉ。

从表中可见，反应时间为８分钟时与１分钟比较，大部分氨基酸衍生物的萤光强度

有不同程度的减弱。反应温度对氨基酸衍生

物萤光强度的影响不大，故本实验选择衍生化反应的时间为１分３０秒，温度为２５。

（五）线性关系

Ｌｉｎｄｒｏｔｈ等提出，在邻苯二甲醛及β－琉基乙醇与氨基酸衍生化反应过程中，只要

保证衍生试剂过量１００倍，固定反应时间所

得到的不同浓度的氨基酸衍生物的响应值是

线性的，回收率接近１００％。在分析生理体液样品时，衍生试剂可被生理体液中的胺消表１衍生化反应时间对氨基酸萤光强度的影响

耗，导致定量的线性关系被破坏〔７〕。因此本实验适当增加了邻苯二甲醛和－巯基乙醇的

用量。用这一衍生试剂分析氨基酸标准品时，在１０３００毫微克／微升范围中，线性关系

的相关系数平均为０．９９６±０．００７（ＳＤ）；在血

浆样品稀释１０１７．５倍的范围中，各氨基酸

表２

各氨基酸线性关系的相关系数的线性关系的相关系数平均为０．９８９±０．０１３

（ＳＤ），列于表２。

（六）实验的精确度

采用上述的实验条件，分析所获得的保

留值和峰面积的重现性较好。各氨基酸保留时间的变异系数平均为０．３３％０．２６％（ＳＤ）；各氨基酸峰面积的变异系数平均为１．７２％

１．２５％，分别列于表３、表４。

表３各氨基酸峰面积的重复性表４各氨基酸保留值的重复性

（七）回收率

测定生理体液中游离氨基酸时，要先去

除其中所含的蛋白质，Ｉｋｏｕｏ等曾比较了多种

蛋白质沉淀剂的作用，发现以苦味酸、乙醇

和５－磺基水杨酸较好，回收率较高〔１２。乙

醇与本实验所用的流动相的性质相似，故我们选择无水乙醇作蛋白质沉淀剂。氨基酸标

准品定量加入血浆中，再以无水乙醇沉淀血

浆蛋白质，然后取上清液作回收试验，各氨

基酸的回收率为９２％０７％，平均为９６．８

４．５％（ＳＤ）。参考文献〔１〕Ｇ．　Ｗ．　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，　＂Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｔｉｏ－ｎ＂，　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｃｋｋｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　ｐ．１０１，　１９７８２〕Ｗ．Ｊ．　Ｈａｇｇｅｒｔｙ，、Ｊｒ，　＂Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ／ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ＂．Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｃｋｋｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｖｏｌ．１０，　Ｐ．６７９，１９７９３〕Ａ．　Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ，＂Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ＂．Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｃｋｋｅｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　Ｐ．３７，１９８１．〔４〕Ｊ．　Ｒ．　Ｂｅｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｐ．　Ｅ．　Ｈａｒｅ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７２，　６９（１９７５）〔５〕Ｊ．Ｗ．Ｄｏｌａｎ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１６５，　３１（１９７９）．〔６〕Ｈ．Ｐ．Ｌａｒｓｅｎ　ａｎｄ　Ｆ．Ｇ．Ｗｅｓｔ，　Ｊ．　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．，　１９，　２５９１９〕．７〕Ｐ．　Ｌｉｎｄｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｋ．　Ｍｏｐｐｅｒ，　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，５１，　１６６７（１９７９）．〔８Ｊ．　Ｃ．　Ｈｏｄｇｉｎ，　Ｊ．　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，　２，１０４７（１９７９．〔９〕Ｈ．　Ｅｎｇｅｌｂａｒｄｔ，　＂Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ＂，　Ｓｐｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ，　ＢｅｒｌＰ．　９６，１９７９．１０Ｒ．　Ｆ．　Ｃｈｅｎ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙ．　Ａｃｔ，５７６，　４４０（１９７９）．１１〕Ｍ，　Ｒｏｔｈ，　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４３，８８０（１９７１）．１２Ｉｋｕｏ　Ｏｈａｒａ　ａｎｄ　Ｓｈｏｊｉｒｅ　Ａｒｉｙｏｓｈｉ，　Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，４，　１４７３（１９９）．（收稿日期：２９８年８月２日）Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｆｒｅｅ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｌａｓｍａ　ｂｙＲｅｖｅｒｓｅｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ－ｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｅｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅ－ｔｅｃｔｉｏｎ　Ｌｉｒａ　Ｈｕａ，　Ｌｉｕ　Ｚｅ－ｍｉｎ，　Ｚｈｕ　Ｗｕ－ｍａｎ　Ｄｅ－ｐｒｍｅｎｔ　ｏＩｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｚｈｏｎｇ　Ｓｈａｎ　Ｈｏ－ｓｐｉｔａｌ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｆｉｒｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　．Ｌｉｈｏｎｇ，　Ｗａｎｇ　．Ｓｈｏｕ－ｄｏｎｇ，　Ｊｉａｎｇ　Ｘａ－ｈａｎｇ，Ｒｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｌｉｃ　Ｒｅｓｉｎ，　Ｓｈａｎｇｈａｉ．Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｒｅ　ｕｓｕａｌｌｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ａｍｉ－ｎｏ　ａｃｉｄ　ａｎａｌｙｓｅｒ，　ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｂｙ　ｃｌａｓｓｌｃａｌｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｂｙ，　ｐｏｓｔ－ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉ－ｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ　ａｎｄ　ＵＶ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，　ｉｓ　ｑｕｉｔｅｔｉｍｅ　ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ，　ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄｓ．　Ｓｏ　ｗｅ　ｈａｖｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｔｒｉｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｓｅ　ｆｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎｐｌａｓｍａ　ｗｉｔｈ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｈｙ，　ｕｓｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ，　ｏ－ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ／２－ｍｅｒｃａｐｔｏｔｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．　Ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｗｅｎｔｙ　ｔｗｏｐｌａｓｍａ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｔ　ｏｎｅ　ｒｕｎ　ｗｉｔｈｉｎ　ｆｉｆｔｙ　ｍｉ－ｎｕｔｅｓ．　Ｔｈｅ　ａｐｐａｒｅｎｔ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｒｅｓｉｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，　ｓｈｏｒｔ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｍａｌｌ　ｓａｍａｌｌ　ｓｉｚｅ　ｈｉｇｈ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｃｙ，　ａｎｄｈｉｇｈ　ｒｅｃｏｒｖｅｒｙ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（９５．８％±４．５％）。Ｗｅ　ｈａｖｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔｃｏｕｌｄ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｂｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，　ａｎｄｄｉｓｃｌｏｓｅｄ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ　ａｓ　ｐｒｏｇｒａｍ　ａｎｄ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｅｌｕｔｉｏｎ，　ｐｒｏｐｅｒｔｙａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｌｕｍｎ，　ｐＨ　ａｎｄ　ｉｏｎ　ｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉ