03 细胞凝集反应及血细胞形态观察

山东大学实验报告2018年3月26日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：1-1科目：细胞生物学实验题目：细胞凝集反应及血细胞形态观察学号：201600140055一、目的要求1、细胞凝集反应①了解细胞膜的表面结构。

②掌握凝集素促使细胞凝集的原理。

③学习研究细胞凝集反应的方法。

2、血细胞形态观察①掌握血涂片的制备方法。

②认识红细胞及各种白细胞的典型形态。

③掌握人体血型（ABO型）的检验原理与检验方法，同时了解自己的血型。

二、实验原理1、凝集反应：细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。

细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。

目前认为，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生，都和细胞表面的分枝状糖分子有关。

直接凝集反应：直接凝集反应指颗粒性抗原（细菌、螺旋体和红细胞等）在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现的凝集现象。

常用的凝集方法有玻片法和试管法两种。

间接凝集反应：间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联在与免疫无关的、大小合适的颗粒状载体表面，使之形成致敏颗粒，然后与相应抗体（或抗原）反应，在适宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称为间接凝集反应。

常用的载体颗粒有人O型红细胞、绵羊红细胞、乳胶颗粒等。

如载体颗粒是红细胞，称间接血凝试验；若为乳胶颗粒，则称为乳胶凝集试验。

2、凝集素：凝集素是一类含糖（少数例外）并能与糖转移结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。

目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。

常用的为植物凝集素，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。

在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（又称为糖萼）。

凝集素能与细胞外被中的糖分子连接，在细胞间形成“桥”，从而引起细胞凝集。

凝集素引起的血细胞凝集，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同；另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异结合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物。

人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。

另外，凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面展示出了十分广阔的应用前景。

而凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。

3、土豆块茎凝集素：土豆块茎凝集素是一种能结合几丁质的富含羟脯氨酸的糖蛋白，单体分子量约50,000，包含至少三个不同的结构域，其中富含胱氨酸的区域与麦胚凝集素等几丁质结合蛋白具有同源性。

土豆凝集素含有50%（质量分数）的糖组分，其中90%是阿拉伯糖，另有少量半乳糖；最丰富的氨基酸是羟脯氨酸，其次是半胱氨酸。

土豆凝集素在水中主要以单体形式存在，能于细胞膜寡糖链上的N-乙酰葡萄糖胺特异性结合，这是其具有凝集活性的主要原因。

4、凝血因子：凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。

它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且堵塞血管上的漏口。

这个过程被称为凝血。

整个凝血过程大致上可分为两个阶段，凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成。

凝血因子一部分由肝生成。

可以为香豆素所抑制。

为统一命名，世界卫生组织按其被发现的先后次序用罗马数字编号，有凝血因子Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ，Ⅻ，Ⅻi等。

5、ABO血型：ABO血型是根据红细胞膜上是否存在抗原A与抗原B而将血液分成4种血型。

红细胞上仅有抗原A 为A型，只有抗原B为B型，若同时存在A和B抗原则为AB型，这两种抗原俱无的为O型。

不同血型的人血清中含有不同的抗体，但不含有对抗自身红细胞抗原的抗体。

ABO血型鉴定主要用于临床输血，在皮肤、肾等器官移植的时候选择ABO血型相符的供体；不孕症和新生儿溶血症病因的分析及亲子鉴定等。

我国各族人民中A型、B型及O型血各占约30%，AB型仅占10%左右。

6、血细胞：血细胞是存在于血液中的细胞，能随血液的流动遍及全身。

以哺乳动物来说，血球细胞主要含下列三个种类：红细胞：红细胞也称红血球，是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介。

哺乳动物成熟的红细胞是无核的，也没有线粒体，它们通过分解葡萄糖释放能量。

在机体中主要起运输氧气和二氧化碳的作用。

白细胞：白细胞是一类无色、球形、有核的血细胞。

白细胞不是一个均一的细胞群，根据其形态、功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞又可根据胞质中颗粒的染色性质不同，分为中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞三种。

白细胞的主要功能是防卫作用。

不同种类的白细胞以不同的方式参与机体的防御反应。

血小板：从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质，对机体的止血功能极为重要。

血细胞约占血液容积的45%，包括红细胞、白细胞和血小板。

在正常生理情况下，血细胞和血小板有一定的形态结构，并有相对稳定的数量。

7、各血细胞的形态：①红细胞：呈双凹圆盘状，中央较薄周缘较厚，无核或细胞器，胞质内充满血红蛋白。

②血小板：血小板有质膜，没有细胞核，一般呈圆形，体积小于红细胞和白细胞，个体大小差异很大，但不是本次试验中的观察对象。

③中性粒细胞：占白细胞总数的50%-70%，细胞呈球形，核的形态多样，有杆状核、有分叶核，一般为2-5叶。

④噬酸性粒细胞：占白细胞总数的0.5%-3%，细胞呈球形，核常为两叶，细胞内充满粗大、均匀、略带折光性的噬酸性颗粒，染成橘红色。

⑤噬碱性粒细胞：占白细胞总数的0-1.5%,细胞呈球形，核分叶或成S形或不规则形，着色较浅；胞质内含有嗜碱性颗粒，大小不等，分布不均，染成蓝紫色，可覆盖在核上。

⑥单核细胞：占白细胞总数的3%-8%，它是白细胞中体积最大的细胞，呈圆形或椭圆形。

胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则性等；核常偏位，染色质着色较浅；胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒，使胞质染成深浅不匀的灰蓝色。

⑦淋巴细胞：占白细胞总数的20%-30%，圆形或椭圆形，大小不等，细胞核圆形，一侧常有小凹陷，染色质致密成块状，着色深，核占细胞的大部，胞质很少，在核周成一窄缘，嗜碱性，染成蔚蓝色，含少量嗜天青颗粒。

三、实验用品1、实验材料：土豆块茎、家兔。

2、实验器具：酒精棉球、双凹片、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管、离心机、注射器、取血针。

3、实验试剂：抗凝血剂（枸橼酸钠盐）、PBS试剂、生理盐水、ABO血型检测试剂。

四、实验步骤1、细胞凝集反应①取土豆去皮块茎2克，切碎并加10ml PBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。

②用针管抽取一定体积的抗凝剂，并使抗凝剂充分浸润针管各部以及针头。

然后从兔子耳根处或心脏抽取兔子静脉血1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。

重复三次离心，最后按沉淀的红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。

③在双凹片的左孔（左右可以通过贴便签来分别）滴加一滴PBS缓冲液，同时在双凹片的右孔处滴加一滴土豆凝集素。

④在双凹片的左右孔同时滴加一滴1%的红细胞悬液，然后使左右孔内的液体都充分混匀。

⑤左手捏住双凹片的一端，右手轻轻摇晃双凹片，使凹槽内的液体充分的混合，如此摇晃5～10 分钟，观察结果，并在初始时间、5min、10min时分别拍一张照片作为记录。

⑥在观察到细胞凝集后用滴管吸取少许细胞悬液，滴在载玻片上，可根据悬液浓度用生理盐水进行一定程度的稀释，之后在显微镜下观察并拍照。

2、血涂片的制作和观察①用取血针在兔耳耳根静脉处轻扎一小孔，右手持一载玻片蘸取少许小孔处流出的兔血。

②左手持另一洁净载玻片（虎口张开，用拇指和食指中指掐住载玻片两头），右手持蘸有兔血的载玻片呈大约30°锐角在左手所持载玻片的表面上涂出一道血膜，静置干燥。

③涂片干燥完成后置于染色架上，滴加瑞氏染液，用染液将血膜表面覆盖，染色一分钟后，再加等量的缓冲液与染色液上，浸染5~8min，此时涂片表面呈现一层古铜色。

用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后自然晾干，即完成血涂片染色。

④在显微镜下观察血涂片，找到血液中几种较为典型的血细胞，拍照记录。

3、ABO血型的检测①取一块洁净载玻片，在载玻片左右两边分别第一滴抗A凝集素试剂和抗B凝集素试剂。

②用取血针在中指扎一小孔，用两支洁净的各吸取少量血液，加入载玻片上的两滴试剂中。

③用手不断摇晃载玻片，大约10min后通过观察两滴试剂中血液的状态判断血液来源者的血型。

五、实验结果1、细胞凝集反应兔红细胞在加有土豆块茎凝集素的凹槽中发生凝集，在白色纸张背景下，约7 min时可清晰看到液滴中出现红色沙状细胞凝集颗粒，以下附上实验开始时、开始5min、10min、16min后的试验照片，以及试验开始时及结束时（16min）的左右对比图：图1 初始时兔红细胞悬液 图2 反应5 min 后兔红细胞悬液图3 反应10 min 后兔红细胞悬液 图4 反应16 min 后兔红细胞悬液图5 反应初始时刻兔红细胞悬液对比图（左加缓冲液，右加土豆块茎凝集素）图6 反应16min 时兔红细胞悬液对比图（左加缓冲液，右加土豆块茎凝集素）图7 显微镜下兔红细胞凝集颗粒照片（4×10）图8 显微镜下兔红细胞凝集颗粒照片（4×40）结果叙述：①兔红细胞悬液在加入土豆块茎凝集素并不断摇晃后逐渐凝集，血浆透明度逐渐升高，悬液中红色逐渐由氤氲雾状变为细沙粒状，7min时在白色纸张背景下可以看到细小红色颗粒随摇晃动作而晃动，之后颗粒感逐渐增强，至16min可清晰看到细小粉粒状红细胞凝集粒（如图4,6）。

②显微镜下既可以看到零散的红细胞，又可以看到更多的以类似于叶绿体类囊体状态堆叠起来的红细胞凝集颗粒（如图7,8），凝集程度不等，2到数十枚红细胞凝集，图中状态为稀释五倍后的结果，且避开了中央红细胞团粒堆积位置。

2、血涂片的制作和观察显微镜下可以看到棕色微紫的红细胞，紫色与红细胞大小相近的淋巴细胞，以及紫色比红细胞更大的粒细胞和单核细胞，以下为显微摄影照片：图9 红细胞（4×40）图10 单核细胞（4×40）图11 淋巴细胞（4×40）图12 中性粒细胞（4×40）图13 噬酸性粒细胞（4×40，图片来源于娄皓宁）图14 噬碱性粒细胞（4×40，图片来源于娄皓宁）结果叙述：①红细胞在显微镜下呈棕带紫色，周缘色深而中央色浅，整体呈圆饼状。