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外周血细胞形态学检验及技巧卫生部北京医院血液科郑天林卫生部临床检验中心彭明婷谷小林陆红五．血细胞形态学采样、制片染色与检查要求：( 一) 采样、制片及染色，三道工序至关重要，是细胞形态学检查的成败关键。
要得到合格的涂片标本，做好上述工序，应注意以下要求：1. 采样、制片：(1) 玻片要求：国内1.0mm × 26mm × 76mm ± 0.5 ，美国NCCLS 规定1.0mm × 25mm × 75mm ± 0.5 ，要严格清洁，接近中性.(2) 推片：选择优质推片，推片两端边缘整齐、平滑。
也可选用有机玻璃，其大小、厚度与坡片相同，两端之边缘应加工光滑，以利推片用。
(3) 采外周血（样），擦去第一滴血，迅速采血，量适中，如绿豆粒大小，具有一定推片技术，推片倾斜45 °±，推成血膜长度25mm ～35mm ，宽度18 ～20mm ，血膜四周留有空隙区，血膜终尾离玻片终端至少10mm ，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，迅速扇（摇）干，血膜具有头、体、尾不同厚薄区域。
此外，涂片时，还要考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、WBC 或有核细胞多少等因素，调整推片技巧。
(4) 如若采用静脉血推片，用K 3 -EDTA 或肝素抗凝，推制血片应尽早进行（最迟在1 ～2 小时内）。
（二）染色：是识别细胞形态的重要标记工序：常规瑞氏- 姬姆萨染色要点：1 ．要得到满意、漂亮的血细胞染色标本，新鲜涂片迅速染色是很重要的。
2 ．染色液配制要合格；3 ．涂片切勿用甲醛固定，否则不着色；4 ．染色的好坏与染色液、缓冲液的质量及比例、加液间隔时间、保持玻片染色液面的张力等染色技巧均有重大关系。
染液要覆盖涂膜面，再加缓冲液（1:2 ），其量要充足、混均，染色时间要30 分钟以上。
5 ．细胞着色的观察：(1) 当染液与缓冲液混合后，甲醛吸水液温升高，发生剧烈反应，直至液膜表面的“染色粒”呈均匀分布，随染色时间的推延，“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”，逐渐由外缘向内缘推进至染色面中心（此过程需要20-30 分钟以上），则表明细胞着色已完成，(2) 再用自来水缓流冲洗，使染色液沉渣及染色粒浮去，使其充分起分色作用，去除细胞染色中浮色，显示出胞核结构及细胞清晰形态，待干，镜检。
外周血细胞形态学检验及诊断技巧病理性形态学改变：①中性粒细胞●中性粒细胞分叶分化程度，○被认为从干细胞至粒细胞生成是否正常及与粒细胞年龄相关；如核分叶不良，Pelger-huet现象；○核仅一叶或二叶，其百分率增加时谓之"左移"，反之，多数细胞四叶以上谓之右移，○一般认为正常中性粒细胞胞核分叶情况：--4叶者为15~25%3叶者为40~50%--2叶者为20~40%1叶者为5%--5叶以上者提示有巨幼细胞性贫血的可能。
○右移现象：-多见于巨幼细胞性贫血、肝脏疾患，并可以5叶与4叶所占比例计算，得出简单实用的分叶指数：分叶指数=5叶/4叶100%正常核分叶指数：0~17%还见于缺铁性贫血、类风湿性关节炎、遗传性高分叶症(显性遗传)及某些败血症(以左移多见)。
○左移现象-见于感染、败血症、出血、小儿慢性中性粒细胞减少症等。
●中性粒细胞毒性颗粒及空泡改变：中性粒细胞由于受到外来刺激(包括感染及应激反应)引起颗粒变性，粗大着色深染及浆内空泡等病理性改变。
上述改变及白细胞数增多和出现幼稚及原始细胞则为类白血病反应。
○慢性粒细胞白血病(CGL)的中性成熟粒细胞一般胞浆颗粒较正常稀少，但无空泡及毒性颗粒，而慢性中性粒细胞白血病(CNL)的中性成熟粒细胞则与类白血病反应形态相似。
○假性嗜酸性颗粒形态异常：类似嗜酸性样颗粒的出现。
-在某些干细胞疾病如MDS、粒细胞缺乏症、肾性贫血某些患者中性粒细胞的颗粒增多○遗传性白细胞异常疾病：是先天性白细胞异常疾病，临床上虽罕见，但为了提高辨别的能力，应有所认识。
○Pelger-Huer白细胞异常：属于显性遗传，其白细胞形态特点：核分叶不良，不分叶，核呈花生形、亚铃形等形状，无核丝形成，胞浆正常，此外，还有假性(即继发性)Pelger-huet白细胞异常应加以鉴别，后者常见于急性肠炎、伤寒、疟疾、流感，无家族史，但在原发病得到治疗后白细胞形态恢复正常。
○Alder-Reilly颗粒异常：常染色体隐性遗传性多糖代谢障碍性疾病，常伴有软骨畸形、肝、脾肿大等，中性、嗜酸性及嗜碱性粒细胞含有多量嗜天青颗粒遮盖整个细胞，单核细胞亦有类似改变。
外周血细胞形态学检验外周血细胞形态学检验是一种常用的临床检验方法，用于评估血液中各类血细胞的数量、形态和功能状态。
它是通过显微镜观察和分析血液涂片中的血细胞形态特征，从而提供有关疾病诊断、病情评估和治疗监测的重要信息。
在外周血细胞形态学检验中，主要包括对红细胞、白细胞和血小板的形态特征进行观察和分析。
首先，红细胞的形态特征主要包括大小、形状和颜色。
正常情况下，红细胞应呈现出均匀的大小和形状，颜色应为淡红色。
若红细胞形态异常，如出现大小不一、形状不规则、颜色异常等情况，可能提示存在贫血、溶血、骨髓异常等疾病。
其次，白细胞的形态特征主要包括细胞形态、细胞核形态和细胞核染色质分布。
正常情况下，白细胞的形态应呈现出规则、对称的形状，细胞核形态应符合相应的类型特征，细胞核染色质分布应均匀。
若白细胞形态异常，如细胞形状不规则、细胞核形态不正常、细胞核染色质分布不均匀等情况，可能提示存在感染、白血病、免疫系统异常等疾病。
最后，血小板的形态特征主要包括大小、形状和数量。
正常情况下，血小板应呈现出均匀的大小和形状，数量应在正常范围内。
若血小板形态异常，如大小不一、形状不规则，或者数量异常增多或减少，可能提示存在出血、血液病等疾病。
通过外周血细胞形态学检验，可以帮助医生对许多疾病进行诊断和病情评估。
例如，对于贫血患者，可以观察红细胞形态是否异常，从而确定贫血的原因是缺铁性贫血、再生障碍性贫血还是溶血性贫血。
对于白血病患者，可以观察白细胞形态是否异常，帮助确定白血病的类型和分期。
对于感染性疾病，可以观察白细胞形态和数量是否异常，帮助判断感染的病原体和感染的程度。
对于血小板减少症患者，可以观察血小板形态和数量是否异常，帮助判断凝血功能是否受损。
需要注意的是，外周血细胞形态学检验虽然能够提供许多重要的信息，但它并不能作为独立的诊断手段，通常需要结合其他临床检查和病史来综合分析和判断。
此外，由于血液涂片的制备和染色的过程可能存在一定的操作误差，因此在进行外周血细胞形态学检验时，临床医生和实验室技术人员需要严格遵守操作规范，保证检验结果的准确性和可靠性。
临床检验——外周血细胞形态学基础（二）一、中性粒细胞浆上颗粒增粗/中毒颗粒1、瑞氏染色/油镜①中性粒细胞浆中出现粗大、分布不均的蓝黑色颗粒称中毒颗粒。
②粒细胞浆上颗粒增多增粗见于细菌感染，中毒颗粒见于严重感染、败血症等。
二、中性粒细胞浆空泡变性/Dohel小体1、瑞氏染色/油镜①Dohel小体为中性粒细胞浆内出现的嗜碱性区域，多呈斑块状、梨形或云雾状等。
②中性粒细胞浆上或核上出现空泡及Dohel小体，见于严重细菌感染、败血症等。
三、各阶段中性粒细胞1、瑞氏染色/油镜四、各阶段淋巴细胞1、瑞氏染色/油镜五、各种形状淋巴细胞1、瑞氏染色/油镜六、各种形状异型淋巴细胞1、瑞氏染色/油镜①异型淋巴细胞体积大，15-25um，胞浆丰富，深灰蓝色，靠核处染色浅，细胞边缘着色较深。
②见于病毒感染，尤其是EB病毒感染。
七、各阶段单核细胞1、瑞氏染色/油镜①原始单核细胞核呈类圆形或不规则，核染色质呈细网状，疏松交织，核仁1-3个大而明显，浆呈蓝色或灰蓝色。
②幼稚单核细胞核不规则，有凹陷或折叠，染色质疏松网状或条索状，浆呈灰蓝色有细小嗜苯胺蓝颗粒。
八、各种形状单核细胞1、瑞氏染色/油镜①单核细胞形态变化较大，呈圆形或不规则，可见伪足或边缘呈毛刺状，胞浆丰富，呈灰蓝色、半透明的毛玻璃状，可见许多细小且分布均匀的淡红色嗜苯胺蓝颗粒，部分浆上可见空泡，核较大呈肾型、U形、马蹄形或分叶形，有折叠、凹陷、扭曲等。
九、粒细胞浆上可见到的颗粒1、瑞氏染色/油镜十、各种形状嗜酸性粒细胞1、瑞氏染色①嗜酸性粒细胞呈圆形或椭圆形，胞浆充满橘红色颗粒，圆形立体感和折光性强，似鲤鱼卵，核分两叶，呈眼镜形，颗粒与核之间界限明显。
十一、各种形状嗜碱性粒细胞1、瑞氏染色/油镜①嗜碱性粒细胞浆上含有大小不一，数量不等，分布不均的深紫色颗粒，常盖在核上轮廓不清，嗜碱性颗粒与胞核之间似有相连，核分叶模糊。
十二、中性粒细胞分叶过多1、瑞氏染色/油镜①核右移指中性粒细胞的细胞核出现4、5叶或更多，其比例超过3%。
外周血细胞形态学检验及诊断技巧主讲：卫生部北京医院郑天林录制：卫星卫生科技教育网监制：卫生部科教司一.概述（一）血细胞形态学基本概念（二）血细胞形态学检查方法（三）血液学及血细胞形态学临床应用（四）临床 /形态学诊断与血液学检验及专业人员素质问题二．形态学及血液检查与自身特性（一）血常规检查（二）白细胞分类（三）骨髓外周血细胞形态学及分类（四）血细胞涂片特性三．血细胞染色法（一）细胞染色机理（二）瑞氏染色（三）姬姆萨染色（四）瑞氏 - 姬姆萨染色液鉴定（五）瑞氏 - 姬姆萨混合染色四．血细胞形态学采样、制片与检查程序（一）采样、制片、染色工序至关重要（二）涂片染色五．外周血细胞形态学检验技巧（一）WBC 形态学（二）红细胞形态学（三）出现有核（内 /巨幼）红 / 幼粒细胞意义（四）血小板巨核细胞六．外周血细胞形态学检查步骤、注意事项及检查报告书写内容（一）注意事项（二）外周血涂片检查步骤（三）外周血涂片报告内容一、概述（一）血细胞形学基本概念血细胞形态学是血液病基础诊断与血液学检验的重要项目•正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正常范围，不同血细胞及细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。
•观察血细胞形态和数量及其比例的变化来研究造血器官的结构和功能是血液学的重要组成部分，是诊断造血系统疾病最基本、被临床普遍应用的最简便实用的检查方法。
•在造血系统疾病发生造血功能紊乱，引起血细胞形态学的量和质的改变。
在临床各科某些原发性疾病患者出现继发性血液学形态学的病理改变，籍以了解患者机体状况如感染（细菌、病毒、寄生虫、药物）等反应。
•血细胞形态学检查是为临床提供诊断依据，应备有患者的临床表现基础检查初步诊断的病历摘要，才能进行形态学检查。
必要时还要做骨髓活检（切片、活检材料滚片、活检穿刺针残液图片）细胞化学染色 , 免疫学表型等检查的必备程序。
•血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成，必须平行进行检查。
外周血细胞改变往往反映骨髓病变的重要信息，有利于诊断。
•疑似血液病和血液学检查异常情况不能只依赖使用分析仪做血常规检查而废弃镜下血涂片细胞形态学检查的错误倾向。
（二）细胞形态学检查方法 1．光镜细胞形态学；细胞形态学的基本内容和常用的检查方法，广泛用于临床方法。
2．细胞化学染色：是细胞和化学两者相结合的形态学方法，保持细胞完整组织结构显示化学结构成分- 定性/ 半定量，主要用于白血病分型鉴别诊断3．相差镜检查：用于观察活细胞的内部结构及活动，细胞生长成熟衰亡过程及对各种刺激的反应4. 荧光显微镜检查用荧光染色血细胞，常用于 DNA RNA勺检查。
近年来由于流式细胞仪的应用而逐渐被替代。
5. 电镜（透射 / 扫描）观察细胞超微结构改变了不少光镜细胞结构概念，在形态学上是对光镜的一个重要扩展和补充。
6. 骨髓组织病理学检查是对骨髓涂片检查的一个重要补充，相互补遗提高诊断水平。
（三）血液学及血细胞形态学临床应用：•是临床血液病诊断与治疗及临床医学检验学的基础工作。
•血细胞形态学适用于临床血液病诊断的基础诊断快速简捷的要求。
•近年来由于血细胞学及超微结构、细胞化学、造血干细胞及其细胞因子、骨髓造血微环境、基质细胞、树突状细胞、淋巴系细胞发生及其疾病表现，细胞增殖动力学与细胞凋亡以及骨髓组织病理学免疫学、细胞遗传学、融合基因、分子生物学的血液分析仪、流式细胞仪的应用，推动了血液病与血液学的新知识迅猛发展。
•当前血液病不能单凭临床与形态学作出诊断，必须以临床和血细胞形态学为基础，将免疫学、细胞遗传学及分子生物学新知识、新技术应用到血液学中，构成现代临床血液学与分子生物学诊断技术，弥补形态学的经验性与主观性带来负面缺陷，才能提高血液病的诊断与治疗水平达到WH新分类的分子生物学水平。
•进入 90 年代以来，国内外采用多学科联合技术综合诊断技术与方案：O FAB-AL （1976）、NCL （美国国家癌症研究所 1990）对FAB-AL分型的补充建议、AL-MIC分（类）型及MICM分型（1985-1990 ）;O FAB-CL分型（1989）、中国 CL分型（1997）;O FAB-MDS分型（1982）、MIC协作组对FAB-MDS分型提出补充建议（1987）;O WHO寸造血系统及髓系恶性疾病和淋巴系恶性肿瘤WH毋类（2000）•血细胞形态学诊断技术正在进入显微图象软件时期：O创造出许多多功能软件，如血细胞形态学、细胞化学染色、血液病诊断与鉴别诊断、CL诊断与治疗及教学系统多媒体软件等。
O将显微镜与微机相连，应用储存、分类、检索软件，编辑、打印诊断报告，并可附多幅细胞图象。
（四）临床 - 形态学诊断与血液学检验及专业人员素质•普遍存在临床与实验室知识面分离现象：O临床医师缺乏实验室知识和技能，甚至不掌握基本形态学能力，诊断依赖实验室报告O实验室人员往往缺乏血液病基本知识与诊断及鉴别诊断的能力“就形态论形态”，常有报告不确实•具备临床与细胞形态学等实验室技术、知识的双重本领及其相互融合十分重要。
缺其一都是血液专业上的缺陷。
•随着血液分析仪普及和档次升高而忽视废弃形态学检查的错误倾向。
即是最好的五分类血液分析仪也不能替代镜下形态学观察，否则导致延误或漏诊严重错误的发生•形态学诊断是十分费时、细致、艰苦的工作，来不得半点虚假，因此 , 形态学专业人员要具有高素质的基本条件：O要充分发挥人的主观能动性；O要具有较高的形态学水平、全面的临床与血液学及有关边缘学科知识，才能算得上德材兼备的优秀专业人才。
O因此只有认真观察与思维才能发现问题，解决问题。
应牢记著名微生物学家-巴士德铭言“在观察的领域中，机遇总是偏爱那些有准备的头脑”。
•树立起临床疾病的正确思维程序，遵循循证医学起到“纲举目张”的功效。
是指导在临床和检验实践中确立诊疗时应以个人知识与技术和当前获得最佳的临床资料与参数有机的结合起来，充分运用诊断与检验技巧在工作中取得更多的客观依据，才能把血液病诊断与血液学检验提高到新的高度。
所谓技巧就是解决实际问题的诀窍。
二．形态学与血液检查与自身特性（一）血常规检查（Hb RBG WBC PIT、血细胞比积、RBC-MCV MCH MCHC及血小板容积曲线）•用自动化仪器提高工作效率，•为使结果准确可靠，必须建立监测方法，搞好质控，此属数值质控。
•我国已较普遍开展全国、省、市（地区）质控。
但普遍存在应付质控质量的问题，并未能切实解决自身质控问题。
（二）白细胞分类：•白细胞分类的自动化已普遍应用，只能为患者普查与筛选之用。
遇有问题应用显微镜观察，弥补自动化仪器缺陷。
•一般医院显微镜档次偏低，分辨率低，维修和正确使用欠缺，提高显微镜档次更好地发挥光镜的观察效应。
（三）骨髓及外周血细胞形态学及分类：•是血液病临床诊断的依据及临床各科患者基本检查可反映原发性疾病的继发性血液学病理改变。
•临床血细胞形态学诊断检查的程序和内容应包括临床资料（血常规）初步诊断内容及血细胞形态学（骨髓外周血）。
•必要时还要做细胞化学染色、骨髓组织病理学等检查的完整概念。
（四）血细胞涂片自身的特性：1 •涂片不易均匀：由于血液是混悬液，其中白细胞、RBG血小板的形态大小、比重及生物活性和血浆成分等的不同和制片技术差异、细胞分布不均匀性差异颇大。
2. 细胞分布与分类的非随机性：•细胞分类标准与观念不一；•采样和计数 100~200 个白细胞的局限性；•细胞分布的生理变动；3. 与疾病的相关性；4. 形态学质控：•室内、室间分类不一致性，开展室间质控也是促进形态学质量稳定的一种手段。
•自1983年以来，澳大利亚皇家病理学质控中心和英国皇家进修学院WHC质控中心及最近美国洛杉矶质控中心，国内：全国及省地市也普遍开展，由质控标本涂片发展图片指定细胞识别。
•必须健全诊断报告审核制度、专业进修、讲习班、读片研讨会等学术交流，是提高形态学诊断质量的保障。
三.血细胞染色法（一）细胞染色机理：染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用，使其清楚显示细胞各个组成部分，有利辨识细胞形态。
•染色可分二个步骤：1 .染料受相应物质吸附而附着于物质表面；2. 固着作用：O即染色粒子进入细胞内起化学反应（染料透过细胞膜的学说很多，尚无定论），与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。
O染色剂皆有选择作用，其染色不是将细胞全部一齐着色，而只是将其中一部分染色，多余的被冲洗掉。
目前多以吸附学说（电力吸附、机械吸附、化学吸附）来解释。
•一般染色方法由两种染色剂（酸性、碱性）组成：通常细胞核及浆内粒体为碱性，细胞浆为酸性。
O酸性染料可和带正电荷的（碱性）物质结合，这种物质称嗜酸性物质，对酸性染料具有亲和力，因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质；O碱性染料可和带负电荷的（酸性）物质相结合，这种物质称嗜碱性物质，对碱性染色粒具有亲和力。
O另一种蛋白质在PH6.4呈等电状态，本身所含的正/负电荷相等，既能和酸性染料又能和碱性染料结合，这种物质称中性物质，如中性粒细胞之颗粒。
•一般用 pH6.4 PBS 来稀释染液：O在恒定条件下着色，使染色效果趋于一致。
O染液过碱时，蛋白质带有负电荷，对次甲蓝有色部分的正电荷吸附力强染成的细胞一般着色较蓝，说明 PH 不适合。
•染色与固定亦有极大关系：O因细胞经固定后，其蛋白质的电力吸附（电附）可能有变化，有些固定液能将细胞某部分的电附加强，使其染色更为容易。
O伊红与胞核虽无电附仍有机械吸附，能染上少量红色，苏木液与胞浆虽无电附但也有机械吸附，因而胞浆略显蓝色。
•血细胞的染色多采用瑞氏染色和姬姆萨染色两种，o作者取其两种染色的优点，采用瑞氏和姬姆萨混合染色法，比单用一种染色法更佳。
O—些快速和改良染色方法及染色液商品化，对血细胞形态染色不一定适用。
（二）瑞氏（Wright' s staim ;美蓝一伊红Y）染色：1、瑞氏染液：⑴瑞氏染液是由碱性染料美蓝（Methvlem blue ）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝—伊红Y）染料。
（ 2）用甲醇作瑞氏染液溶剂，即成瑞氏染液。
甲醇是瑞氏染液良好溶剂，有两种作用：•甲醇使瑞氏染液中美蓝（M与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。
甲醇ME （瑞氏染液）M+ + E-在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。
•甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。
