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包涵体蛋白复性及其影响因素

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第24卷第5期河北工业科技Vol.24,No.5

2007年9月HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnologySept.2007

文章编号:100821534(2007)0520314203

包涵体蛋白复性及其影响因素于文国,陶秀娥(河北化工医药职业技术学院制药工程系,河北石家庄　050026)摘　要:针对包涵体需经过细胞破碎、变性溶解、复性处理后才能形成具有一定空间构象的生物活性蛋白,且复性处理是一个非常复杂的生化反应过程,只有选择合理的方法,控制适宜的条件,才能提高蛋白的复性效率,综述了包涵体蛋白复性的方法,分析了影响复性的有关因素。

关键词:包涵体;溶解;复性;影响因素中图分类号:Q512 文献标识码:A

WaysandinfluencefactorsforrenaturationofproteininclusionbodiesYUWen2guo,TAOXiu2e(DepartmentofPharmaceuticalEngineering,HebeiChemicalandPharmaceuticalVocationalTechnologyCollege,Shijiazhuang

Hebei050026,China)

Abstract:Toformactiveproteinwithanactiveconformation,processessuchascrushing,dissolvingandrenaturalizingare

needed.Therenaturationisaverycomplicatedbiochemistryprocess.Onlybyselectingtheproperwayandcontrollingsuitableconditionscanweraisetheefficiencyofproteinrenaturation.Thispapersummarizesthestrategiesforrenaturationofinclusionbodies,andanalysesthefactorsthatinfluncerenaturationofproteininclusionbodies.

Keywords:inclusionbody;dissolve;renaturation;influncefactors

包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。一般含有50%(质量分数)以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、外膜蛋白ompF、外膜蛋白ompA、环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5～1μm,具有很高的密度(约为1.3mg/mL),无定形,非水溶性,可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。经破碎、分离、洗涤、变性溶解得到的包涵体蛋白必须经过复性处理,才能使目标蛋白恢复其生物活性。复性操作是采用合理的方法使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的具有生物活性的折叠结构,同时去除还原剂,使二硫键正常形成的过程。

收稿日期:2007204206;修回日期:2007206205

责任编辑:张士莹作者简介:于文国(19692),男,河北丰宁人,副教授,主要从事生物、医药专业教学及管理方面的研究。

1　包涵体蛋白复性方法1)稀释复性　该方法是在蛋白变性溶解液中直

接加入水或缓冲液(或缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中[1])

,然后静置一定时

间,通过稀释蛋白变性溶解液中变性剂的浓度来消除变性剂对蛋白的影响,进而使蛋白重新折叠,恢复具有活性的空间立体结构。目前稀释复性主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释3种方式。2)透析复性

[2]　该方法是将变性溶解的包涵体

蛋白溶液置于透析袋内,通过逐渐降低外透液的浓度来控制变性剂的去除速度,使蛋白恢复其生物活性。3)超滤复性

[3]　该方法是将变性溶解的包涵体

溶液通过超滤膜除去变性剂而使蛋白复性。4)层析柱复性　该方法是将变性溶解的包涵体

蛋白上样并吸附在经缓冲液平衡的层析柱上,然后用清洗缓冲液洗掉未被吸附的变性剂和杂蛋白质等,最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱并实现复性。这种复性方法主要有离子交换层析(IEC)法[4]、凝胶过滤层析(GFC)法[5,6]、疏水层析(HIC)法[7～9]、亲和层析(AFC)法[10～12]等。5)膨胀床吸附复性

[13]　该方法是将变性的包

涵体蛋白溶液以一定的流速通过吸附床,通过控制流速实现床层的膨胀但不流化,细胞碎片和不被吸附的物质从床层的空隙间通过后流出床层,而变性蛋白吸附在床层内的吸附剂上,然后用一定的缓冲液洗涤床层,除去杂质后再用洗脱液将变性蛋白洗脱下来得以复性。6)温度跳跃式复性

[14]　蛋白质先在低温下折

叠复性以减少蛋白质聚集的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度可促进蛋白质折叠复性。7)双水相法

[15]　该方法是在双水相系统中加

入盐酸胍,再把变性还原的蛋白质溶液加入其中,变性蛋白在向某一水相分配过程中由于逐渐脱离原变性剂的影响而得以进行复性,这种方法要求复性的变性蛋白质的浓度必须低。8)反胶团法

[16]　该方法是将变性溶解的包涵

体蛋白溶液引入到含有反胶团的溶液中(或在蛋白质的变性溶液中加入形成反胶团的有机溶液),蛋白将会插入到反胶团中,并与形成反胶团的表面活性剂的极性头作用,逐渐进行复性。这种方法通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反胶团中,利用反胶团的包裹作用,将变性的蛋白质一个一个地包裹起来,有效地避免了蛋白质间的相互聚集,同时利用交换缓冲液而逐渐降低反胶团中的变性剂浓度,并加入氧化还原剂,使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象。复性后除去表面活性剂,就可以获得高生物活性的蛋白质。

2　影响复性的因素蛋白质复性是一个非常复杂的过程,除与复性过程中有关的操作条件或环境因素有关外,在很大程度上还与蛋白质本身的性质有关[17～19]。复性过程的关键是控制好条件,不使蛋白分子形成无活性的聚集体,而使蛋白分子内的次级键与二硫键能正确形成,进而折叠成特有的空间结构。下面简要介绍影响蛋白质复性的主要因素。2.1　变性蛋白的情况变性蛋白分子内不应存在二硫键,如果在蛋白变性溶解过程中没有控制好还原剂的加入量而使二硫键彻底还原,将会使蛋白复性效率下降。

2.2　蛋白质的质量浓度正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用所造成的,蛋白质的质量浓度是使蛋白质聚集的主要因素。质量浓度大时,分子间距离较短,相互间容易作用而结合,形成沉淀,故复性时蛋白质质量浓度宜低;蛋白质质量浓度小时,获得的蛋白质复性效率比质量浓度大时要好得多,但过小又给后处理带来不便,一般选择其质量浓度为0.01～0.1mg/mL,以促进分子内相互作用,避免分子间相互作用引起聚集。2.3　pH值复性缓冲液的pH值必须在7.0以上,这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率,最适宜的复性pH值一般为8.0～9.0。选择pH值,应避免在蛋白质等电点处进行复性。在等电点时,蛋白质的溶解度最小,静电排斥力几乎为零,相互间疏水作用区域就容易发生作用而形成聚集体。2.4　氧化还原电势较好地控制氧化还原电势对于形成正确的二硫键非常必要。氧化还原电势过小,不容易形成二硫键;氧化还原电势过高,蛋白间易形成二硫键,使二硫键发生错配。常用的控制方法有空气氧化法、氧化还原电对法。2.5　添加剂在蛋白质复性过程中常用的添加剂有如下几类。1)聚乙二醇

[20]　这类物质含有疏水和亲水2

种基团,疏水基团同蛋白折叠中间体作用,亲水基团朝着溶液中,防止折叠体之间相互作用,阻止聚集的产生。另外,聚乙二醇还可增加溶液黏度,使折叠体的运动受阻,折叠体与折叠体之间就不易结合,从而促进蛋白质的复性过程。一般其质量分数在0.1%

左右,具体用量可根据实验条件确定。2)二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI)　PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢复到正常的结构。此外,在复性过程中蛋白质的脯氨酸2种构象间的转变需要较高能量,常常是复性过程中的限速步骤。PPI的作用是促进2

种构象间的转变,从而促进复性的进行。3)盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类

[21]　这

类物质在非变性浓度下是很有效的促进剂,它们自身并不能加速蛋白质的折叠,但可能会通过破坏错误折叠中间体的稳定性,或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。4)氨基酸　其主要作用是创造一个适合于活性

513　第5期 于文国等　包涵体蛋白复性及其影响因素

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包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

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包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

蛋白质的复性

蛋白质的复性


流加稀释复性 复性液中蛋白质初始浓度=0.边流加、边 复性。故变性蛋白质浓度始终保持在较低 水平，有利于提高复性收率，且终浓度较 高。
蛋白质复性的影响因素
浓度
增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行
温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（＞40℃） 蛋白质的聚集将十分严重
pH值
通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免 与蛋白的pI值相近
疏水键的相互 作用强度
蛋白质复性
包涵体形成的机制： U←→I←→N U：指完全去折叠的状态， I：指折叠中间体（也称融球态 molten globule state） N：指天然的成熟的状态
蛋白质复性
Mitraki和King提出了以下包涵体的形成模型：

IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体 IPm未可形成单体的中间体 IPf*为形成包涵体的形式
第五章 蛋白质的复性
蛋白质的复性
为什么要进行蛋白质的复性？
外源基因导入E.coli等宿主细胞并表达蛋白质产 物（ r-干扰素，白细胞介素-2，人生长激素等） 时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质 的活性。所以要进行蛋白质的复性。 1.什么是包涵体？ 2.为什么选择原核表达系统（特别是 E.coli ）？
蛋白质复性
包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素： (1) 复性蛋白的浓度,为防止蛋白质分子间发生聚 集,复性蛋白的浓度要尽量稀,一般控制在25-75 ug/mL为好. (2) 复性缓冲液要保持适当的氧化还原条件.一般 GSSG（氧化型谷胱甘肽）和GSH之比为1为好. (3) 复性缓冲液的pH要通过实验来确定最适值. (4) 复性溶液中要加入适当的labilizing 试剂,如L 精氨酸,可提高复性产率.
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

梯度透析法及稀释法蛋白的复性

梯度透析法及稀释法蛋白的复性

蛋白的复性重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白以包涵体的形式存在。

导致包涵体形成的主要原因有以下几点：⑴重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

⑵重组蛋白所处的环境：诱导温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

⑶重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

⑷有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。

包涵体复性在世界范围内都是个难题，最好的复性方法也不会超过20%。

目前大家在这方面研究也比较多，有研究证明一些分子伴侣有助于蛋白的复性；同时稀释、透析、渗透是最经典的蛋白复性的方法；另外氨基酸如精氨酸、糖类、醇类、表面活性剂对蛋白的复性都有辅助作用，还有很多的表达系统可以助复性。

本公司主要通过梯度透析和稀释的方法对变性蛋白进行复性。

梯度透析法梯度透析缓冲液配方：PBS（1L）：8.0NaCl、28.65gNa2HPO4·12H2O、0.234gNaH2PO4·2H2O缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M盐酸胍溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM β-巯基/乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素复性缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl (pH8.5)、100mM NaCl、6M/4M/2M脲素、1%甘氨酸、5%甘油、0.2%PEG、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽包涵体纯化及复性操作步骤：若蛋白以包涵体的形式纯在，则需要从包涵体中纯化出目的蛋白：1、大量诱导表达菌液，5000g离心10min，弃上清，用缓冲液A重悬，超声波破碎，功率45%，工作2s，暂停2s，破碎10min，，10,000g离心10min。