包涵体蛋白质复性-纯化

板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。

）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。

常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。

因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。

我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。

我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。

至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。

我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。

看着没问题，实际上是有毛病的。

关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。

缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。

那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。

我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。

三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。

我要说都是文章的作者在忽悠。

不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。

且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。

在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3?mM。

去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。

基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。

包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。

1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。

研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。

原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。

3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。

）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。

常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。

因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。

我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。

我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。

至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。

我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。

看着没问题，实际上是有毛病的。

关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。

缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。

那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。

我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。

三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。

我要说都是文章的作者在忽悠。

不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。

且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。

在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化与复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点:较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠复性方法易于放大等。

蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7、0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。

此外可以用温与去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。

同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上。

包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,使多肽延伸。

盐酸胍就是较尿素强的变性剂,它能溶解尿素不溶的包涵体。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。

另外,从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。

这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。

二硫键的形成与断裂就是可逆的,直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。

常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱,溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性,成(8-10M)70-90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(6-8M)溶解能力达95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3 mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

6HIS 包涵体蛋白纯化—复性方法
1．摇500ml菌至OD小于0.5时加IPTG在37℃诱导表达3小时。

2．离心，将沉淀置于-20℃冻融。

(可无)
3．用8M尿素重溶沉淀：先用0.5ml tris-cl buffer 将沉淀吹打成悬浮状，再加入20ml 8M尿素，摇匀，室温于脱色摇床上摇20分钟，充分溶解沉淀。

4．12000rpm,15℃以上离心15分钟。

5．挂柱：取上清与平衡好的镍柱柱料混合，室温于脱色摇床上摇20分钟。

6．WASH:ph8.0尿素（8M）十倍体积
7．洗脱：PH5.0
8．选浓度OD在1.0以上的来透析，透析之前加1mMDTT,两种buffer:
IB solubilization(10×):caps(3-[Cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid) 500mM PH11.0 N-lauroylsarcosine(30%)10×
Sometimes: 3M NDSB(10×)
9．先加到4M 尿素in Tris 50mM，并加DTT到1mM按PH8.5
10. 降至2M, 成分同上，并加150mMNaCl
11. 降到1M 同10
12. 最后透析液：Tris 50mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
PH8.2
13.再透析去掉DTT。

一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。

此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。

对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。

4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。

包涵体纯化蛋白复性得方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体得纯化与复性总结包涵体折叠复性得方法应具备以下几个特点:较高得活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度得蛋白;折叠复性方法易于放大等。

蛋白复性得过程通常分为以下几个步骤:包涵体得洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体得洗涤通常选用浓度较低得变性剂,如2Ｍ尿素在５0mM Trｉｓ,ｐH７。

0－8。

5,1mＭEDTA中洗涤包涵体。

此外可以用温与去垢剂ＴritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。

同时,因为去垢剂得洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度得尿素或高浓度得NaCｌ,使包涵体得纯度达到50%以上。

包涵体得溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间得相互作用,打断包涵体蛋白分子间得各种化学键,使多肽延伸。

盐酸胍就是较尿素强得变性剂,它能溶解尿素不溶得包涵体。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Saｒkosｙl等也可以破坏蛋白内得疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。

另外,从某些含有半胱氨酸得蛋白质中分离出得包涵体,通常含有一些链间形成得二硫键与链内得非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DＴT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。

这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用得二硫化物置换试剂所取代。

二硫键得形成与断裂就是可逆得,直到最有利得蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。

常用变性剂对比尿素(8－１较盐酸胍慢而弱,溶解度为7用尿素溶解具有不电离,呈中性,成0Ｍ)０－90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解得包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(６-8M)溶解能力达9５%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质得共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀ﻫ对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体得复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展得变性状态恢复到正常得折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成、一般在尿素浓度4Ｍ左右时复性过程开始,到2M左右时结束;盐酸胍可以从4M开始,到1、5M时结束。

IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。

用蒸馏水彻底清洗透析袋。

放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。

冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。

从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。

最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。

1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min(离心时间和速度应该都不够)。

沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶（暂时我没用）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。

破碎后的匀浆，4℃、12000 rpm离心15 min。

分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

重复一次。

再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。

12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（即结合buffer）：20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。

大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。

但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。

包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。

但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。

现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。

第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。

包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。

包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。

有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。

包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。

包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。

此外刚处理完的包涵体好溶解。

冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。

如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。

2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。

包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。

洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50mM NaCL。

这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。

洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。

EDTA为0.1-0.3mM。

去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。

它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。

蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。

包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。

此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。

包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。

盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。

SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。

另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。

这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。

二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。

常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。

制备包涵体1、超声破碎细胞2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体.3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100液洗涤2 次4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体,包涵体蛋白的变性复性方法一1、在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\LEDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液2、剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解3、4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀4、加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h5、以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.方法二1、在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解.2、4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀3、所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.检测1、取出30 uL 备用2、向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃沸水处理5～10 min, 离心后取5 uL 上清上样, SDS-PAGE 检测相关试剂Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。

板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过.）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。

常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化,对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题,工艺的重复性和放大往往出现问题.因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧.我做纯化时,初始工艺摸索用的菌体量一般为10g 左右。

二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。

我要讲的是,一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。

至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜,也不关心。

我们判断的依据只是SDS—PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中,我们就认为是包涵体表达,但这是一个似是而非的结论。

看着没问题，实际上是有毛病的。

关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中,而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。

缓冲液A和B的差别可能只是pH 上相差1-2个单位。

那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢?说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等.我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的,在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。

三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50％等等。

我要说都是文章的作者在忽悠。

不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS—PAGE的扫描分析吧.且不说一个SDS—PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。

在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20％的条带要它变成30%又有何难?我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。