显微镜的使用及细菌形态观察

实验一普通光学显微镜的使用和细菌形态观察一、实验目的1．了解普通光学显微镜的构造和原理。

2．学习并掌握普通光学显微镜——油镜的使用方法。

3．利用油镜观察细菌的形态和构造。

二、实验原理微生物学研究用的普通光学显微镜通常有低倍物镜（16mm，10×）高倍物镜（4mm，40-45×）和油镜（1.8mm，95-100×）三种。

油镜常标有黑圈或红圈（或白圈），它是三者中放大倍数最大的。

使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。

这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。

当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。

如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图Ⅰ-1）。

图Ⅰ-1油镜的原理图Ⅰ-2 镜口角利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。

因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。

所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA=nsinθ数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。

可分辨两点之间的最小距离=λ/2NA＝λ/2nsinθ式中λ：所用光源波长；θ：为物镜镜口角的半数，取决于物镜的直径和工作距离。

n：玻片与物镜间介质的折射率，空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52）、玻璃（n=1.52）等。

nSinθ：数值孔径（NA），是决定物镜性能的最重要指标。

由上述可知若n值和α角越大则NA越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大（图Ⅰ-2）。

三、实验器材1．仪器：显微镜。

2．材料：标本片（大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、八叠球菌、炭菌杆菌的芽孢和荚膜、细菌三形涂片），香柏油，二甲苯，擦镜纸等。

细菌形态观察实验报告细菌是微生物世界中的重要组成部分，也是一种常见的微生物。

在本次实验中，我们选择了几种常见的细菌进行形态观察，并通过显微镜观察它们的形态特征和结构。

实验过程中，我们使用了一台光学显微镜。

首先，我们准备了好培养基和适宜的环境条件，养殖了细菌。

在实验时，我们从培养皿中的细菌群落中选取一小部分细菌样本。

为了观察细菌的形态特征，我们进行了涂片制备。

将一个玻璃载玻片放于烧杯中，加入一滴无菌的生理盐水。

然后，用无菌链取适量的细菌样本，均匀地涂抹于载玻片上。

接下来，我们使用热固定法固定了细菌样本。

将涂片置于一个耐热玻璃棒或镊子的两个小夹具之间，将其浸入热水中，烧热片上半部分。

注意不要使玻片变色或裂开。

热解的时间一般约为几秒至数十秒，直到载玻片表面无液滴残留。

固定后，我们使用乔治-吉姆萨染色法染色。

将涂片上半部分烧热的玻片置于染色剂中，使玻片平整且染色液接触整个涂片表面，保持片面湿润。

染色时间控制在1-2分钟即可。

染色完成后，我们将染色的载玻片放在显微镜架的玻璃片上，调整好显微镜的倍率和焦距。

逐个观察每个细菌样本，并在显微镜的视野内找到合适的观察位置。

在观察细菌形态时，我们注意到细菌的形态多样。

有些呈球形，称之为球菌；有些呈棒状，称之为杆菌；还有一些呈弯曲形状，称之为弯曲菌。

除了这些常见的形态外，我们还观察到了其他的特殊形态，如链状、丝状等形状。

在细菌形态中，我们还注意到了一些细菌的结构特征。

例如，许多细菌具有细胞壁，它们可以保护细菌免受外界环境的影响。

另外，一些细菌还有着尾鞭毛或鞭毛，它们可以帮助细菌在液体中移动。

此外，细菌还具有胞内器官，如核糖体和细胞质，这些器官起着重要的生物学功能。

通过这次细菌形态观察实验，我们对细菌的形态特征和结构有了更深入的了解。

通过显微镜的观察，我们不仅可以看到细菌的形态，还可以观察到它们的微观结构。

这对于我们研究细菌生物学特性以及疾病治疗等方面具有重要的意义。

细菌是微生物界中不可忽视的一部分，它们在自然界和人类生活中起着重要的作用。

而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含 量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透
性增大，结晶紫—碘复合物被洗脱，复染时细胞被染
上复染剂的颜色（红色）。
葡萄球菌
大肠杆菌
三、革兰氏染色的操作方法
涂片
干燥
固定
染色
水洗
干燥
镜检
无菌操作
（1）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平
板上取一小环培养24小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌菌体于生理盐水中涂片（，分别于斜面上挑取少许
根据公式D=λ/2n·sin(α/2 ) ，增大分母，使得D
值减小，分辨率增大。
显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视 接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压 碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更 不可倾斜拿。
⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，
用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止， 约20—30s，立即用水冲净酒精。
注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操 作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，
脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
⑺复染：用番红液染1—2min,水洗。 ⑻镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在 低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革 兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
有的形态。
⑵ 干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。 ⑶ 涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操 作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并 使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1—2 次即可。

10 实验10.1 显微镜的使用及微生物形态观察10.1.1 目的要求了解光学显微镜的结构、各部分的功能；掌握光学显微镜的使用、保养方法；观察微生物的形态，学会生物图的绘制。

10.1.2 器材和材料10.1.2.1 仪器或其它用具光学显微镜、镜纸、吸水纸等。

10.1.2.2 溶剂或试剂⑴镜油：香柏油或石蜡油。

⑵镜头清洗液：二甲苯或醚醇清洗液（乙醚70mL，无水乙醇30mL）。

10.1.2.3 菌种米酒酵母、链霉菌、青霉、曲霉、根霉等装片。

10.1.3 实验内容10.1.3.1 显微镜的基本结构普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成，见图10.1。

图10.1 显微镜构造示意图1. 目镜；2. 镜筒；3. 镜臂；4. 标本移动器；5. 粗动限位器；6. 粗调节器；7. 细调节器；8. 镜座；9. 反光镜；10. 虹彩光圈；11. 聚光器；12. 载物台；13. 物镜；14. 物镜转换器（引自钱存柔、黄仪秀. 微生物学实验教程. 北京：北京大学出版社. 1999）⑴机械部分镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地放置在桌子上。

镜臂用以支撑镜筒，也是搬动显微镜时手握的部位。

镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。

镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。

载物台是放置标本的地方。

镜台上有压片夹用以固定被检标本，较好的显微镜则有标本移动器，转动螺旋可使标本前后和左右移动。

有的标本移动器带有游标尺，可定位标本所在位置。

物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3～4个不同放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器选用合适的物镜。

调节器安装在镜臂的基部，是调节物镜与被检标本之间距离的装置，通过转动粗调节器和细调节器便可清晰地观察到标本。

⑵光学部分物镜是显微镜中很重要的光学部件。

根据物镜的放大倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，常用的放大倍数为低倍物镜10×、高倍物镜40×、油镜100×。