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学习参考好帮手 现代分子生物学实验手册
工具酶
基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。 核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。
工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。
一、限制性内切酶（restriction endonuclease）
主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。 （这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）
限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。 保护自身遗传物质稳定的机制。
限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。
命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）
例：
细菌属名 细菌种名 菌株名称 限制酶名称 WORD格式整理版
学习参考好帮手 Arthrobacter luteus Alu I
基因克隆常用的工具酶
在基因克隆过程中，涉及基因的合成、切割、重组及修饰，在这些过程中，需要各种酶的参与。可以说，基因克隆技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的。目前，已经知道的工具酶种类繁多，功能各异，这里主要对聚合酶、内切酶、连接酶和修饰酶等几种常用的工具酶做下介绍。
1.DNA和RNA聚合酶
DNA 聚合酶最早被发现于大肠杆菌中，它们具有在引物存在条件下，以DNA
为模板，沿5′到3′方向，催化合成DNA 的功能。目前，常用的DNA 聚合酶有大肠杆菌DNA 聚合酶I（全酶）、Klenow 酶、T4 DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶及反转录酶等。DNA 聚合酶具有的共同特点为：不能起始新的DNA 链的合成，需要模板和引物，它们催化脱氧核糖核苷酸加到双链DNA 引物链的3′-OH 末端上，催化脱氧核糖核苷酸的聚合，合成新的DNA链。
目前，从大肠杆菌获得三种不同类型的DNA 聚合酶，即DNA 聚合酶Ⅰ、DNA
聚合酶Ⅱ和DNA 聚合酶Ⅲ。DNA 聚合酶Ⅰ和DNA 聚合酶Ⅱ被认为在大肠杆菌中主要是参与DNA的修复，而DNA 聚合酶Ⅲ则是与DNA 复制有关。在基因克隆中主要使用的是DNA 聚合酶Ⅰ。DNA 聚合酶Ⅰ是由大肠杆菌polA 基因编码的单链多肽，相对分子质量为109 kD。它具有三种不同催化活性，即5′-3′聚合酶活性、5′-3′外切酶活性和3′-5′外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ主要用途是通过DNA 端口平移制备用于核酸杂交分析的DNA 探针和对DNA 分子的3′突出末端进行标记。
Klenow 酶是大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理产生的大片段，它的相对分子质量为76 kD。与大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ相比，Klenow 酶缺少了5′-3′外切酶活性，保留了5′-3′聚合酶活性和3′-5′外切酶活性。
在基因克隆中，Klenow酶的主要作用为：
（1）补平限制性内切酶切割DNA 形成的3′末端；
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前言
限制性内切酶是识别特定DNA序列并在识别位点或附近切割DNA的细菌蛋白质。它们于20世纪60年代末在细菌中被发现，并自20世纪70年代初以来成为重组DNA技术的基石到目前为止，已经鉴定了超过3600种限制性内切酶，具有超过250种不同的特异性，其中超过250种现已商业化，可用于分子生物学的常规应用。
大多数限制性内切酶(即II型酶)只能识别短的DNA序列(48个碱基对)，这极大地限制了它们在重组DNA技术中的应用。为了克服这一限制，蛋白质工程被用来改变天然存在的限制性内切酶的序列特异性，但收效甚微。
另外，人工限制性内切酶(AREs)是通过将DNA结合域融合到核酸酶结构域(例如，锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活物样效应核酸酶(TALENs))或使用簇状规则间隔短回语重复(CRISPR)相关酶9 (Cas9)在体外产生的。与天然限制性内切酶相比，该酶具有更高的特异性。然而，它们没有产生明确的粘性或钝性末端，这是限制性内切酶的标志，并且由于它们的单一或极低的周转率而显示出相当差的活性。此外，很难获得足够的数量和纯度。所有这些限制都极大地限制了它们在体外的应用。
酶学性质
Argonaute蛋白是一类可以结合短核苷酸的蛋白质，在生命的所有领域都是保守的。在真核生物中，Argonaute蛋白是RNA沉默机制的关键参与者。
真核生物Argonautes能够结合小RNA分子，可以作为引导物在特定的位置切割与它们结合的RNA向导互补的目标RNA分子的酶在原核生物中，大多数目前鉴定的Argonaute蛋白被认为在宿主防御入侵遗传因子中起作用。与真核Argonautes不同，一些原核Argonautes有能力使用小的DNA分子而不是RNA作为向导来切割ssRNA或11c ssDNA靶标。
PfAgo是一种原核生物Pyrococcus furiosus的Argonaute蛋白，它被用作可编程的核酸内切酶，可以基于gDNA的引导来切割底物。
限制性内切酶
1，发现
限制性内切酶能保护细菌不受噬菌体的感染，行使微生物免疫功能，缺乏限制性内切酶的大肠杆菌极易被噬菌体感染，但是如果拥有限制性内切酶，被感染的几率就会降低。
限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌几乎都能编码限制性内切酶。
2，限制-修饰（R-M）系统
大多数限制性内切酶常常伴随有一两种修饰酶（DNA甲基化酶），从而保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。
修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。甲基化所形成的甲基基团能够伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋的大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用，即组成R-M系统。
在R-M系统中，有些限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，独立行使自己的功能，有些本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同的亚基或同一亚基的不同结构域分别执行自己的功能。
3，分类
最常用的II型限制性内切酶，能够在识别序列内部或附近特异性的切开DNA链，产生特性的片段和凝胶电泳条带，是唯一一类能用于DNA分析和克隆的限制性内切酶。
限制性内切酶切割后产生一个3-羟基和5-磷酸基，只有当镁离子存在时才具有活性，而相应的修饰酶则需要S-腺苷甲硫氨酸的存在。
备注：
NEBuffer: Tris-HCl , MgCl, DTT（二硫苏糖醇，强还原剂）
星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，称为星号活性。使用高保真内切酶，即经过基因工程改造降低了星号活性。
同裂酶：识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶，第一个被发现的内切酶称为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称为原酶的内裂酶。
4，甲基化
（1）原核生物甲基化
在原核生物中，DNA甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。
Dam甲基化酶：GmATC
