限制性内切酶的一般原则和建议!

限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。

通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。

上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。

新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。

研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。

这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。

直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。

上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。

这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。

随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。

限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。

例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。

限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。

因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。

二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。

被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。

例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。

另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。

2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。

即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。

并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。

用Universal Buffer和Basal Buffer进行限制酶活性表示TaKaRa公司，为了方便限制酶的统一使用，采用了通用缓冲液 (Universal Buffer) 测定限制酶活性的体系 (5种通用缓冲液中，用标注的)，以此时的活性值作为100%。

并把在其它通用缓冲液中的相对活性表示如下表。

有 ( ) 标记的是易受Star活性影响的缓冲液，为了避免Star活性的影响，希望尽量使用或标注的缓冲液。

每种限制酶都有其自身的基本缓冲液 (Basal Buffer)，其中AccⅢ、BalⅠ、BcnⅠ、BglⅠ、Bpu1102Ⅰ、Cfr10Ⅰ、Eam1105Ⅰ、Eco52Ⅰ、NruⅠ、Psh BⅠ、Sna BⅠ、SspⅠ、TaqⅠ、VpaK11B Ⅰ(共14种)由于没有十分合适的通用缓冲液，只能使用基本缓冲液(Basal Buffer)。

各种限制酶的基本缓冲液组成不同，相互之间不能通用。

各种限制酶在基本缓冲液中的相对活性也被列于下表，供参考。

限制酶在各种缓冲液中的相对活性附带·活性测定用Buffer 推荐使用的Buffer*1+0.01%BSA→100%: Afl II, Aor13H I, Eco O65 I, Fok I, Hin1 I, Mun I, Nco I, Pvu I, Sse8387 I, Xba I *2 +0.01%BSA+0.01%Triton X-100→100%: Not I按Universal Buffer分类的限制酶各Universal Buffer的组成■ 使用注意事项10×Buffe r都为10倍浓度的缓冲液。

此外，10×T溶液中不含BSA，在使用时将BSA添加进去，使最终浓度为0.01%，有些限制酶(带有*1或*2标记)的反应体系中需加BSA或Triton X-100，添附的溶液是10倍浓度 (0.1%) 的液体，使用时，请在反应体系中添加1/10量进行反应。

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）1、目的及适用范围利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。

2、主要试剂及仪器微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer3、操作步骤按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。

反应物体积（μL）灭菌水3DNA4010× Buffer K 5EcoR I1BamH I1总体积504、问题向导4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。

通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。

如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。

4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。

识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。

假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。

内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。

粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。

4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。

酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。

酶的用量视在底物上的切割频率而定。

例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。

21。

质粒 DNA 的限制性内切酶酶切分析实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法重组技术的关键工具。

并理解限制性内切酶是 DNA 重组技术的关键工具。

2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。

它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。

上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。

首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的 Hind II 和 Hind III。

这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的基因片段。

研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。

1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。

各种细菌都能合成一种或几种能够切割 DNA 双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源 DNA 存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的 DNA 不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA 进行了修饰，限制性酶对修饰过的 DNA 不能起作用。

这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。

2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ型* Ⅲ型第一类（I 型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割 DNA 链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。

这类酶如 EcoB、EcoK 等。

第三类（III 型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。

但这几个核苷酸对也不是特异性的。

因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末端。

限制性核酸内切酶相关知识归纳限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。

1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。

化学本质为蛋白质。

②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。

③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。

④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。

如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。

2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。

②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。

2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。

如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。

切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。

②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。

2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。

如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。

一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。

不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效[很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

三、操作步骤1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。

2. 酶切反应体系（10ul）：酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U) 底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）灭菌ddH2O 加至10 ul限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。

限制性内切酶原理限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一种常见的酶类，能够帮助细菌对抗侵入的病毒DNA，通过识别特定的DNA序列并将其切割成特定的片段。

限制性内切酶具有辨识性、切割性和钳制性、修复性四个基本特点。

限制性内切酶启示了分子生物学领域的许多实验技术，如DNA测序、聚合酶链反应（PCR）等，在生命科学研究中得到广泛应用。

限制性内切酶的辨识性是指它们能够识别DNA序列中的特定短序列，并只切割该序列。

每种限制性内切酶具有特定的辨识序列，也称为限制性酶切位点。

这些辨识序列通常是4-8个碱基对长，具有特定的配对规则，如EcoRI的辨识序列是5'-GAATTC-3'，其中A和T配对，G和C配对。

在DNA双螺旋结构中，限制性酶通过辨识序列与DNA结合，形成特异性的结合位点。

限制性内切酶的切割性是指它们能够在辨识序列的特定位置切割DNA双螺旋结构。

限制性内切酶通常通过切割特定的磷酸二酯键来断裂DNA链。

它们在辨识序列的特定位点周围创建一个切割位点，通常是辨识序列两侧的不同位置，如EcoRI在辨识序列的前后各切割一个磷酸二酯键，形成两个单链断裂端。

限制性内切酶的钳制性是指它们能够将切割的DNA片段留在切割位点附近，形成特定的断裂端。

例如，EcoRI在切割DNA后会在切割位点的切割位点之间留下两个黏性末端，形成一个单链和一个突出的单链片段。

这种特定的断裂端形式通常有助于进一步的DNA处理和连接。

限制性内切酶的修复性是指它们能够修复被切割的DNA。

在细菌细胞内，限制性内切酶的活性通常伴随着相应的修复酶系统，可以恢复被切割的DNA双链结构。

这种修复过程有助于防止细菌自己的DNA也被限制性内切酶过度切割。

限制性内切酶在分子生物学研究中得到广泛应用。

通过利用限制性内切酶的辨识性，科学家可以在特定的DNA序列上进行定点切割。

切割后的DNA片段可以被进一步用于DNA测序、PCR等实验技术。

一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。

限制性内切酶名词解释限制性内切酶又称为限制性内切酶是一种由特定的特定的特定的核酸分子特定的特定位置所识别的酶，它们能够在特定的位置将核酸分子切割成两段，其中一段被称为内切片段，另一段称为外切片段。

限制性内切酶是 DNA变，特别是基因识别和修饰的重要工具，可以将 DNA子切割成两个不同的片段，并且这两个片段可以通过结合的方式来进行重新组合。

限制性内切酶的发现，极大地改变了分子生物学的研究领域，使得科学家们能够更加精确地控制DNA的改变和组装。

限制性内切酶的种类繁多，但它们共有的特点是精确地识别特定DNA片段，并在特定的位置进行限制性切割。

它们曾被广泛应用于全基因组比较、基因调控分析、基因组编辑、克隆方法开发、细胞工程和一些其他的生物科学研究。

限制性内切酶的分解模式是其特有的特征，它们能够在特定的位置精确地分解DNA，使反应具有高度特异性。

它们的作用位置是由特定的DNA序列所决定的，即所谓的“限制性位点”。

它们的分解效率较高，一旦识别了特定的DNA序列，就可以把DNA分解成外切片段和内切片段。

此外，限制性内切酶的精确度也是非常高的，因为它们在DNA分解过程中只在特定的位置进行切割，从而避免了偶然的外切。

另外，限制性内切酶具有一定的灵活性，可以通过增加弱底物吸引力或结合抑制剂来改变它们的功能，以及通过改变活性中心的位点，以改变它们的切割效率。

总之，限制性内切酶因其精确度、分解效率和灵活性而能够大大的改变分子生物学的研究领域。

限制性内切酶在生物领域的应用非常广泛，它们可以用于克隆基因和生物工程，用于分析基因组变异和基因组间水平的比较，和用于细胞工程中细胞表型的改变。

此外，限制性内切酶也被用于生物检测，特别是对病毒感染有重要意义。

比如可以利用限制性内切酶对病毒DNA进行检测，以及其他一些生物标记试剂的检测，以确定特定的细胞和细菌的存在。

另外，限制性内切酶也可以应用于药物开发，用于研究药物潜在的重要靶标，以及如何从DNA中提取药物起始分子。

酶切注意事项酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。

DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。

当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。

如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。

若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。

若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。

一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20 C条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于 12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1邓艮制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH;②Co2+、Mn2+、2n2+取代 Mg2+;③酶浓度大于25u/ug ；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在（＞12%）；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中 DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul 。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA然后加入适量 NaCl及第二种酶，继续反应;②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与ZDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。

限制酶选择原则一、限制酶选择原则是啥呢1. 特异性要强这就好比找对象，得找独一无二的。

限制酶要能够准确地识别特定的核苷酸序列，不能到处乱切。

要是特异性不强呀，就会像个糊涂蛋，把不该切的地方也切了，那可就乱套了。

比如说我们想要对某个特定基因进行操作，如果限制酶特异性不好，可能就会破坏其他有用的基因部分呢。

2. 切割位点要合适这就像裁衣服，要在合适的地方下剪刀。

如果切割位点不合适，可能会导致切出来的片段不符合我们后续实验或者操作的要求。

比如说我们想把一个基因片段插入到某个载体中，如果切割位点不好，可能就没法顺利地连接上去。

而且有的时候我们希望得到特定长度的片段，切割位点的选择就更加关键啦。

3. 酶的活性要稳定就像人要保持健康活力一样。

酶的活性稳定是很重要的。

如果活性不稳定，今天还能好好工作，明天就不行了，那我们的实验或者操作就没法顺利进行了。

在不同的环境条件下，比如不同的温度、pH值等，酶都应该能够保持一定的活性，这样我们才能放心地使用它。

4. 要考虑成本毕竟咱们不是土豪呀。

有些限制酶可能很贵，如果有更便宜又能满足需求的酶，那当然优先选择便宜的。

当然，不能仅仅因为便宜就选择不好的酶，还是要综合考虑前面提到的那些因素。

就像买东西一样，性价比很重要呢。

5. 来源方便如果一种限制酶来源很困难，要从很远的地方或者通过很复杂的程序才能得到，那也会给我们的工作带来很多麻烦。

就像你想要吃个苹果，如果苹果只有在很远的山上才有，那还不如选择附近超市就能买到的香蕉呢。

所以限制酶要是来源方便的话，就可以随时满足我们的需求啦。

6. 与其他酶的兼容性在一些复杂的操作中，可能会用到多种酶。

这时候限制酶要和其他酶能够和谐共处，不能互相干扰。

比如说有的酶可能会影响限制酶的活性，或者限制酶会破坏其他酶的工作环境，那肯定是不行的。

就像一群小伙伴一起做游戏，大家要互相配合才行。

限制性内切酶的一般原则和建议1．如何做酶切反应？该问题看似什么简单：DNA 中加上酶，然后保温一段时间就可以了。

但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。

问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyma这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。

您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。

下面几点对你的酶切是有帮助的。

1)成功酶切的关键是准备好模板DNADNA羊品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性) ，不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTRTE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。

2) 选用合适的酶。

根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。

3) 正确使用和保存酶。

酶需要保存在-20 度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。

运输和临时存放时需要将酶至于冰上。

手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。

用完后需要及时送回原处。

注意：酶通常是最后加。

所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul ，酶切鉴定10-20ul就可以了。

5)模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。

浓度过低，也会影响酶活性。

6) 注意模板用量和反应体积的关系。

对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。

7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP 小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。

一般不能使用振荡器混匀。

8) 反应温度的选择。

一般反应都用37 度，但是SmaI 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。

部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I 的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。

限制性内切酶的注意事项1)购买的限制性内切酶带有两种不同的酶切缓冲液，该用哪一种？每种限制性内切酶带有一管酶的最适反应液（通常是一种4-CORE反应液），可能还带有一只MULTI-CORE反应液。

2)4-CORE酶切缓冲液体系是什么？大多数（大约75%）Promega公司的限制性内切酶有一种最适酶切缓冲液，即4-CORE酶切缓冲液，分别叫作A、B、C和D。

其余的25%的限制性内切酶带有一种特定的酶切缓冲液（酶切缓冲液E-L）。

每一种限制性内切酶带有一只最适酶切缓冲液。

3)MULTI--CORE酶切缓冲液体系是什么？MULTI--CORE酶切缓冲液适用于双酶切。

每一种Promega公司的限制性内切酶都测试了在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力，如果酶切活力达25%，就提供一只MULTI--CORE酶切缓冲液。

作双酶切时，如果两个酶在MULTI--CORE酶切缓冲液中的活力达到50-100%，就可替代A-L酶切缓冲液。

应选用酶活力最高的酶切缓冲液。

4)如何保存限制性内切酶？不太常用的限制性内切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20 oC。

有一些酶需要不同的保存条件。

每一种Promega公司的限制性内切酶都提供一份分析说明以供查讯。

使用限制性内切酶时，应将酶保存在冰上。

5)一般的限制性内切酶反应中（也叫消化），应用多少内切酶？所用的酶量取决于DNA的纯度、量和型态。

限制性内切酶的活力单位定义为在适当的温度下，在1小时内，1ugDNA在50ul体积中，被完全消化所需的限制性内切酶的量。

一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。

比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。

6)使用限制性内切酶的一般步骤是什么？一般步骤如下：A）测试酶切DNA的量B）计算完全酶切所需的酶量。

为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%（甘油的浓度为5%）。