常用限制性内切酶酶切位点保护残基

现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。

核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。

工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。

一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。

（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。

保护自身遗传物质稳定的机制。

限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。

以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。

命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu I Escherichia coli RY13Eco R IH Ham H IBacillus amyloliquefaciensHaemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。

在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。

若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，Eco RI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，Pa cI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

单实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260位的寡核苷酸。

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2单位的寡核苷酸。

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

Aatll识别位点5；.. G ACGT\；H. .3^ 3•…CJGC AG, , .5JAcc65l识别位点5…G+M K AC …3，3. ..CA KMJG. . 5JAccl识别位点煮…Gl^K AC…3，3J. . CA KMJG. . 5JAcil识别位点5 …(ft GC …3’計…GG空…莎Acll识别位点5 …A A\；GTT .33\ .. T T G C^A A... 5^Acul识别位点5d.. CTG A AG(N)<;\ . . 3J 3d.. GACT TC(N)1<A... 5JAfel识别位点5. .. AGC^CT..,3P3. .. TCGJCGA.. 5JAflll 识别位点5…・C T T T A AG*…3・3：…G A A T T&” …5"Afllll 识别位点5：.. £CR¥(31■…Y &…TGYRqA^.5*Agel识别位点5P. . /fCCGGT ,..3J 3：…TGGCqA .…莎Ahdl识别位点5P. G ACNN F/N NGTC... 3P 3- CTGNI^NNNCAG^.5^Alel识别位点5；. .CACN I T NN GTG 3' 3. ..GTGNI^NNCAC. .. h Alul识别位点5P. .. A(jfcT….3P3…TQSA…hAlwl识别位点5 r,GGATC(N)7「3"3 …CCTAG(N)y £「AlwNl识别位点5：. CAGNNN T CTG..3F3；. GTC^NNNG AC.. .5*Apal识别位点5 .., GGGCtft. ..3P3\., C^CCGGG .ApaLl识别位点5\.. (^TGCAC.. ,3J3 .. CACGTjGApeKl识别位点5P. . . t^CWGC., .3r3\. CGWCjp., .5^Apol识别位点5；,. FLATTY,, ,3J3 , _ Y TTA AJl. T.5"Ascl识别位点5：., GtfCGCGCC. .33 CCGCGCJ J G, .5JAsel识别位点5 . B 4A T't A A T t. , 3J3 . .. T A A TJ A .. 5JAsiSl识别位点5...GCGAl1SGC r. 3r3...CGCJAGCG . .5Aval识别位点可…C TV CGRG…3」3：..GRGCYJ>..hAvall识别位点5：…dfewCC,.,3r3；., CCWG^.. 5JBamHlAvrll识别位点5... C T CT AGG . 3’…GGATCf…5」Bael识别位点5；^(NJACIN^GTAYCCNjJ 3 3.^^NJTGjN^CATRGtN)^ .5^识别位点吕,"・G E AT CC…3’3’…C C T A Gp -.. 5"Banl识别位点吕…G^YRCC^ 33 …CCRYQp^ .5JBanII识别位点5：.. GRGC Y^t …3",C A Y C G R G . ,,Bbsl识别位点5. .,GAAGAC (N)/ . .3r3J. .. 0 T T C T G 减丄…S'BbvCI识别位点5 …C(T T CAGC.”.3*3 …GGAGT A CG.,S JBbvl识别位点5 …GCAGCHN}；…3* 計…CQTCG(N)iar .5^Bccl识别位点5P. . CCATC(N)/,. 33\ , .GGTAG(N). -5rkBceAl识别位点5... ACGGCtNjJ. ,3^3：.. TGCCG(N)F「5*Bcgl识别位点5 . T4N)CGA(NK TGC(N)J . .3J 3；.^(N)GCT(N)；ACG{N)^.b5^BciVl识别位点5. r,GT ATCC (N)J .3F3. ..C AT AGG (N}t^ ..5P Bcll识别位点5... T'feATC A,- 3J 3：…ACT AGJ., 5JBfal识别位点5：.. (?T AG . .3r 苗…GA.C…hBfuAl识别位点5；. . ACCTGC(N)J 3’3. ..TGG ACG(N)^, .5^ Bgll识别位点5；. GCCNNNN^JGGC., 3P 3 . . CGGr^hlNNNCCG. , 5*Bglll识别位点莎…A T G T…3’3：”. TCTAt^A.. 5rBlpl识别位点5•…G(7TN AGO., -3J 3；., CGAN T；CG , .5^Bme1580l识别位点5 . . GKGCWit …才3 . . Q^MCGKG ,5J BmgBl识别位点h…C AC令TC…孑3 . . .GTGJ： AG. . 5*Bmrl识别位点5... ACTGGG(N) T r.3r 3... TGACCC(N)4r..5-Bmtl识别位点h…GCTA(?b …3’3\, C/3 ATCG …5」Bpml识别位点5 .… CTGGAG(N)1P T 3r 3... GACCTC(N)14j...5r BpulOI识别位点5’…CCT T N AGC …*33\., GGAN^CG .. 5BpuEl识别位点5；.. CT TG AG(N)r T,.3'3\.. GAACTC(N)…A...S' BsaAl识别位点5；.. YAC'GTR . .3^BsaBl识别位点5： ..GATNN^NATC , .3^ 3：, ,CTANN/1NTAG,. . 5^ BsaHl识别位点5P. . .GFitG YC . . ,3^3...C YGC^RG.. .5JBsal识别位点5... GGTCTC (N)/. .3^3... C C A G A G (N)^. . . 5' BsaJl识别位点5 c'b NNGG.. 3J3； GGNNC/3,. 5BsaWl识别位点5 . ., w'bCGGW, 3J3•…WGGC即…hBsaXl识别位点5 . ^NjACfN^CTCCtN),；. 3-3r ..(N)TG(N)r GAGG(N). .，& 丄p A BseRl识别位点5…GAG GAG的「…3"3... CTCCTC{N)-A….5PBseYl识别位点5\, CV： CAGC.,. 3J CT…GGGTQ3…可Bsgl识别位点5；.. GTGCAG^N^T. 3J3 ….CACGTC{Nj i4i.. . 5JBsiEI识别位点5, . , CGRY'fcG,, 3r3 . .. GC A YRGC . ,5"BsiHKAI识别位点5；…GWGCW七■…J3：..C^WCGWG.. .5BsiWI识别位点5.C'feT ACG, . 3r 3：…GC A TGJS. 5’Bsll识别位点5' . , CCNNNN I^INGG. , .3r 3；., GGN\NNNNNCC.. ,5J BsmAI识别位点5r ^GTCTC(N)7 .3ri3 . .. C AG AG(N).…h▲BsmBI识别位点5. r,CGTCTC (N)J .3F3. ..GC AGAG (N)s^ ..5BsmFI识别位点覚…GGGAC(N)(D T . 3* 占…CCCTG(N),-A. . .5JBsmI识别位点5 . . . G A A T G C N* . . 3J3. . CT T AC^SN ..5JBsoBI识别位点5P. ..CVCG AG. .,3P3 . ^GRGCY^C . .5^Bsp1286l识别位点5 ….GDGC“b_・F 3〔…qHCGDG …5’BspCNI识别位点5\. CTCAG(N)/ . .3 3：…G AGTC (叽…BspDI识别位点5\ . A T T C G A T , , . 3"3：…T A G qj A「SBspEI识别位点5 …T T CCGGA. . ,3J3 . r AGGCCJ- . 5JBspHI识别位点5 ... T T C ATGA3’…A G T A CJ…翼BspMI识别位点5. ACC TGC (N)/. r. 33. .. TGG ACGBspQI识别位点5 . GCTCTTClNjJ .33LXGAGAAGtN)*^ r MiBsrBI识别位点5 . . . CCdtTC, . .3r3 GGC^pAG. . .5^BsrDI识别位点5；. . GC AATGNN*, .3r3 ：…C G T T A QN N …乳BsrFI识别位点5；, .R^ CGG Y . .. 3"3 ., YGGCC^R …5“BsrGI识别位点5 . lIST ACA .3…AC ATGJ…创BsrI识别位点5：.. ACTGGN T, r孑3：. . TG ACJDN .,. 5^BssHII识别位点5P.., G*CGCGC .. ,3P3.,.CGCGqp.,5^BssKI识别位点5 . . .'tCNGG . .3：.. GGNCq…hBssSI识别位点5 .(T A CGAG ,, .3"3F GTGCTJC .. .5^BstAPI识别位点5..GCANNNIS T NTGCCGT\NNNNACG8G5 阴BI识别位点5 . k. T T'b G A A t, 3J3. . AAGCJ T T5JBstEII识别位点5：.. G'fe T N A C C .. . 3^3 ... CCAhl TGJS.. .5^BstNI识别位点5：..cd\VGG. . . 3P3 . ..GGWCC . . 55：..CTCAG(N)tt^-BstUI识别位点5：.. CG'faG,. .3^3 . .. GCJ3C.. .5^BstXI识别位点5 ANNNNI S T N TGG.,3J3 . f.GGTN A NNNNNACC (5)BstYI识别位点5…R先ATdS3\, YCTAG^R.. .5JBstZ17l识别位点5…GT fT AC…卽3\. CA T^ATG.. .5-Bsu36l识别位点5.…CC?TN AGG. . . 3r3-…G G A N T& C. 5"Btgl识别位点5；,. C?bHYGG,. .33；, GG YRC^C , ,5JBtgZI识别位点5…GCGATG㈣「…3」3；..CGCTAC(N),4J...5,BtsCI识别位点5；. .GCAGTG N N T33：.. C G T C A (^N N ... 5'BtsI识别位点5.,,GC AGTG N N T.3P3；.. C G T C A <^N N ...Cac8l识别位点GCN T NGC . 3J3：…CGN/ICG…密ClaI识别位点ATfcGAT.. . 3J3 …T AGCJ A T. 5CspCI识别位点5 :的CAA (N>( GTGG (N)^.,33：・+严JN) GTT (M), CACC(N}^1V，,5J CviAII识别位点5…C T G…:T3 r.. G T A^C . . S PCviKI-1 识别位点5...RG T C Y (3)才…¥C#GR…5’CviQI识别位点S'-.J J TAC ,.3J3：5枣…5’Ddel识别位点5；-. C^TNAG.. .3J3；, G AN\C.Dpnl识别位点Ch,5 G A T C 3 3；. CT AG 5’DpnII识别位点5；r T GATC..33：r, CT AG^ . 5JDral识别位点5；.. T T T^AA …3’3\Rt A A A/TT . , 5JDralll 识别位点5；h CACNNN'bTG. . ,3“3…GT砂Nhl SC…5」Drdl识别位点5 . , GACNNNN T NWGTC, ,3 3：. . CTGNN^NNNNCAG., .5^Eael识别位点5“…gGCCR …;T3 . ..RCCGG/ .. 5JEael识别位点5, ^YfeGCCR, . 3J..RCCGG/ .Eagl识别位点5... C^SGCCG .3 .. GCCGGf. .Earl识别位点5 …CTCTTC (N)t\ .r3... GAGA AG (N)^. ..5PEcil识别位点5. . .GGCGGA(N)J . .3^GCCT (N)S A.., 5JEcoNI识别位点5： . . CCTNt/NNNAGG 33 . . GG ANNN^NNTCC . 5E CO O 109I识别位点5P. . R(jfeNCC Y …:TS^.YCCNG/SR . . .5EcoP15l识别位点5 r C AGCAG(N)/ . P3r3 …GTCGTC(Wy 5EcoRI识别位点5 . ., A T T C ... 3 r 3；. . CTT AEcoRV识别位点5.GAT^TC -,3*3：.. CT AJ AG.. .5JFatl识别位点5：・先ATG…3」3\t GTAC^ .. 5’Faul识别位点5J CCCGC (N}J.. .3' 3；.. GGGCG (N)#A. . ,5J Fnu4HI识别位点昭…GC’NGC…朝3... CGN&G -SFokl识别位点5\L.GGATG(N)；1T3J3... CCTACtN),^ .5Fsel识别位点5 …GGCCGG'tc, .33 . CC/3GCCGG . . 5J Fspl识别位点5；,. TGC^bC A .. .3P3 ； ,. A C GJC G T (5)Haell识别位点5 RGCGC T Y. . .33 …LCGCGR …5，HaelllHgal识别位点5 . . .GACGC^N}/. 3... CTGCG<N}1(W. . 5" Hhal识别位点5 …GCdt …3" 宙…中CG…5，Hindi识别位点5：f GT Y T R AC.. .3r3\ .. CAR A YTG fHin dlll 识别位点5；. , A'A G C T T .…3" 3... TTCGA^A., .5JHi nfl识别位点5’ …GklMTC …3 3\., CT NAJG., .5* HinPII识别位点亦…dtGC…:r3 ... CGCp . . 5* Hpal识别位点5. .. GTT> AC.. .T3.., C A AJTG. _5J Hpall识别位点5“...cffeGG (3)3. GGC A C. 5JHphl识别位点51 …GGTGA (N)/.,.3, 3；.. CC AC T (N)7i,., 5" Hpy188l识别位点5 …T G “G A「3A0J CT …£Hpy188lll识别位点5.,TtfNNGA. ..3^3.,AGNN^CT. , ,5JHpy99l识别位点5；.. CGWCG T3：F i GCWGC.. ,5^HpyA V识别位点5.h CCTTC(N)J,3-3：. GGAAG(Nk ...5*%HpyCH4III识别位点h…A C N’G T …3"3 .,. T G^N C A … .5 HpyCH4IVHpyCH4Vm别位点5；., Tdt A., .33\,. A(^3T, . .5JKasl识别位点5.., G^J CGCC.,3P3r.^CCGCG^,..5J Kpnl识别位点5.,, GGT AC't... 3^3■…QCATGG …5，Mbol识别位点5P. .^3ATC .3^ 3P.. CT AG^. .5^Mboll识别位点5；., GA AGA (N「…3* 3；,, C T T C T (N)J A，. .5* Mfel识别位点5；.. C'X ATTG. ..3^3；T . GTT A Ajp . . 5JMlul识别位点5... /T CGCGT.,，3r3 ：.. T G C G C^A ... 5JMlyl识别位点5 …GAGTC(N, 一33\. .CTCA G (N) . 5-Mmel识别位点5； . .TCC RAC(N)M T.3' 3： . ,AG G YTG(NJ ia>. ..5*MnII识别位点5 ….CC「C (N}/ . 3 3…GGAG㈣立,5-Mscl识别位点5 , F TG(?fc：C A t,3P 3"…ACC^J GT.+J5JMsel识别位点5... f*T A A.. 3P3；T. A A TJ .. . 5^Msll识别位点5 …CAYNNV IN RYG. .,3J3 ...GTRNN^NNYAC (5)MspAII识别位点5P. . . CMCSfcKG, . .3 3•…GKYMC…扩Mspl识别位点5；F. dfcGG …3’3；. . GGqp …5’Mwol识别位点5 . . G C N N N N NVj N G C.. . 3\_ CGNN^NNN NNCG., Nael识别位点5 ... GCC\3GC,. .3r 3：…GGG&GG-.hNarl识别位点5 …GG^t GCC.. .3 3…CCGQGG …5“Ncil识别位点5 .C(7SGG,. ,3r 肚…GGS&C…・h Ncol识别位点5. ,,C T CATGG,. .3*3\ ,. G G T A CJ3 ... 5JNdel识别位点5； ., C /T T A T G ,. 3^ 3... GT A\AC…hNgoMlV识别位点5 . _ (itCGGC,. 3^ 3•…CGGCC^G. . 5Nhel识别位点5 . • T AGO . .,3"3 …GGATqp …hNlalll 识别位点亍…CATCf…3’AG…hNlalV识别位点5\,. GGt/NCC-.3 .. CCN^NGG.. .5JNmeAlll识别位点5：.. GCCGAG{N—G 3 ...CGGCTC(N)ia.^.^5rNotl识别位点5〔GdtGCCGC …;r3 ...CGCCGtyCG (5)Nrul识别位点5 . BT TCG^GA …3J3 …MCFCT …hNsil识别位点5 .ATGC^T T .. .3^ 3... I^ACGTA .. ,5JNspl识别位点5 . RCATG T Y. . 3J 3；.，X h GTACR.,.5rPacl识别位点5...TTAAf r TAA...3-3：+ , A ATJ A ATT T J+5JPaeR7l识别位点5；.. CG AG . ,3P. +G AGCTJC , . 5JPcil识别位点5：…A%島TGT….3*3* . . TGT A CA.. .S,APfIFl识别位点5；, .GAChiVlNGTC .…扩3 . . . C T G N N A N C A G ... 5* PflMI识别位点5； .. C C A N N N wTl T G G.. . 3^ 3；^GGTN A NNNNACC., .5^ Phol识别位点5：...GGfcC (3)3：. CCjjG.. 5JPlel识别位点5\.. GAGTC .3* 3：. CTCAG (N),,. hMiPmel识别位点5：. GTTT^AAC. . .3J3；.T C AAAJ T TG.T 5JPmll识别位点5；,, C AC^TG.. .33P.. GTGJ：AC- .5HPpuMI识别位点5 , h RdTj W c C Y ・”，3“3；_ YCC WGJ3R ., 5J PshAI识别位点5；ACNl7NNGTC . +.3J3 , . .CTGNNJNNC AG . .5'Psil识别位点5；., TT^T A A…X .. A A T A T T ... S HJLPspGl识别位点5 …1tC WGG …3“3；r,GG WCC^ ,.5PspOMI识别位点5；,. (fGGCCC.,. 3 3：…CCCGGJ3…5’PspXl识别位点5 V(7T CGAGB . b3J3. 8GAGC\CV.. .5* Pstl识别位点5 …CTGC 屆.33；. . G^ACGTC-. S-Pvul识别位点5 …CG ATEG …3" 3；.. GCJ AGC. . . 5JPvull识别位点5；…CAtSfcTG…富. . G T CJ3 A C ... 5^Rsal识别位点5...GT^C (3)3... CAJG.. .5*Rsrll识别位点5；, ,C(?fewCCG.. .3' 3：…GGC W枣C…hSacl识别位点5 GAGCT^ ,3J3；CJCGAG, . 5JSacll识别位点热…CCGC七G 23 .. GGjpGCC . 5JSall识别位点5 G T TCGAC,. 3J 3…CAGCT^S …hSapl识别位点5； .-GCTCTTCtN)^ ,3J 3 . r,CGAGAAG(N)(j.TJ5JSau3AI识别位点5 .. 7G A T c .,. 3^ 3：.. CT AG^..5JSau96l识别位点5... G^SNCC . . 33 …CCNGa ・hSbfl识别位点TGCA T GG.,y 3.., GG/CGTCC , 5’Seal识别位点5：.. A G T鼻C T ...甞3\,. TC AJGA . _5JScrFI识别位点5 ... CCT N GG.. 33\. GGNJSC , . 5JSexAl识别位点5 , .rfbCWGGT., ,3r3 …TGGWCqA. - SSfaNI识别位点5.., GC ATC (N)/ ,.. 3* 3J.,. CGT AG (N)9A，.. 5*Sfcl识别位点5：…(?TR¥AG …;T 3：. .GAYRT^C. . ,5Sfil识别位点5…GGCCNNNhTNGGCC .,3 3. ,CCGGN/tNNNCCGG .5'Sfol识别位点5；., GGC^CC ... 3J 3：…CCGfGG …5，SgrAI识别位点5 …C R’C CG G ¥ G …3"3. ,.G YGGCC jt AC,,,5HSmal识别位点5；., CCC^GG. . 3r3 …GEGfCC 一5"Smll识别位点S^.C T T Y R AG (3)3"…GARY .C …/SnaBI识别位点5 …T Ad A …3’3P r. A T G^： A T .. S HSpel识别位点5；. . zTCJ AGT . ,3r 3：…TGATC^A …hSphl识别位点5.GCATG'fe.. 3J3... CpT ACG . 5Sspl识别位点5 . A AT^TT 3P3. . . T T AJ AA . .5*Stul识别位点5. R1AGdtCT . ,.3f 3：…TCCJSGA. .5HStyD4l识别位点5 .. T CCNGG.,.『3’…GGNCq…5“Styl识别位点5仁C T CWWG G.. ,3r3；, GGWWC A C..Swal识别位点5 . , , A T T TV A A T ・・33 . h. T A A A J T T A ... 5^Taq a l识别位点5：.. T^G A . . ,33：…AGCJ ., 5JTlil识别位点5... <T T CGAG,,. 3J 3…GAGC"…5"Tsel识别位点5 …gfcwGC …3，3 …CGWQG …Tsp45l识别位点5；, ^STS AC.. 33\. .C ASTG^ . 5JTsp509l识别位点5….V A T T… 3-于…TT A. 5“TspMI识别位点C T CCGGG…3’3’…GGGCCf •…5’TspRI识别位点5 .NNCASTGNN T. ,3J3 .. ^NNGTSACNN., .5*Tth111l识别位点5P. . .GACN T NNGTC..3P3'…GTGN 叫NGAG-hXbal识别位点ftT AGA .3’…A G A T GJ…亍Xcml识别位点ANNNN N T J NNNTGG. 33. . .GGTNN N N^NNNNNACC. . 6Xhol识别位点占…C T TCGAG- 33 …GAGC T& …5"Xmal识别位点5：…CtCGGG…計3；.. GGGCqC . . .5*Xmnl识别位点5..,GA ANNVlN T TC . . 3r 3\ .. C T T N NJM N A A G .,.Zral识别位点5：. ,G AC T GTC■…孑3；, CTG A CAG...5-Tfil识别位点5 , . .G^WTC., .3 3 , . XT W .5。

常用限制性内切酶酶切位点总结————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点BbvCI识别位点BbvI识别位点BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点BsiEI识别位点BsiHKAI识别位点BsiWI识别位点BslI识别位点BsmAI识别位点BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点BstXI识别位点BstYI识别位点BstZ17I识别位点Bsu36I识别位点BtgI识别位点BtgZI识别位点BtsCI识别位点BtsI识别位点Cac8I识别位点ClaI识别位点CspCI识别位点CviAII识别位点CviKI-1识别位点CviQI识别位点DdeI识别位点DpnI识别位点DpnII识别位点DraI识别位点DraIII识别位点DrdI识别位点EaeI识别位点EaeI识别位点EagI识别位点EarI识别位点EciI识别位点EcoNI识别位点EcoO109I识别位点EcoP15I识别位点EcoRI识别位点EcoRV识别位点FatI识别位点FauI识别位点Fnu4HI识别位点FokI识别位点FseI识别位点FspI识别位点HaeII识别位点HaeIIIHgaI识别位点HhaI识别位点HincII识别位点HindIII识别位点HinfI识别位点HinP1I识别位点HpaI识别位点HpaII识别位点HphI识别位点Hpy188I识别位点Hpy188III识别位点Hpy99I识别位点HpyAV识别位点HpyCH4III识别位点HpyCH4IV HpyCH4V识别位点KasI识别位点KpnI识别位点MboI识别位点MboII识别位点MfeI识别位点MluI识别位点MlyI识别位点MmeI识别位点MnlI识别位点MscI识别位点MseI识别位点MslI识别位点MspA1I识别位点MspI识别位点MwoI识别位点NaeI识别位点NarI识别位点NciI识别位点NdeI识别位点NgoMIV识别位点NheI识别位点NlaIII识别位点NlaIV识别位点NmeAIII识别位点NotI识别位点NruI识别位点NsiI识别位点NspI识别位点PacI识别位点PaeR7I识别位点PciI识别位点PflFI识别位点PflMI识别位点PhoI识别位点PleI识别位点PmeI识别位点PmlI识别位点PpuMI识别位点PshAI识别位点PsiI识别位点PspGI识别位点PspOMI识别位点PspXI识别位点PstI识别位点PvuI识别位点PvuII识别位点RsrII识别位点SacI识别位点SacII识别位点SalI识别位点SapI识别位点Sau3AI识别位点Sau96I识别位点SbfI识别位点ScaI识别位点ScrFI识别位点SexAI识别位点SfaNI识别位点SfcI识别位点SfiI识别位点SfoI识别位点SgrAI识别位点SmaI识别位点SmlI识别位点SnaBI识别位点SpeI识别位点SphI识别位点SspI识别位点StuI识别位点StyD4I识别位点StyI识别位点SwaI识别位点TaqαI识别位点TfiI识别位点TseI识别位点Tsp45I识别位点Tsp509I识别位点TspMI识别位点TspRI识别位点Tth111I识别位点XbaI识别位点XcmI识别位点XhoI识别位点XmaI识别位点XmnI识别位点ZraI识别位点。

Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点BbvCI识别位点BbvI识别位点BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点BsiEI识别位点BsiHKAI识别位点BsiWI识别位点BslI识别位点BsmAI识别位点BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点BstXI识别位点BstYI识别位点BstZ17I识别位点Bsu36I识别位点BtgI识别位点BtgZI识别位点BtsCI识别位点BtsI识别位点Cac8I识别位点ClaI识别位点CspCI识别位点CviAII识别位点CviKI-1识别位点CviQI识别位点DdeI识别位点DpnI识别位点DpnII识别位点DraI识别位点DraIII识别位点DrdI识别位点EaeI识别位点EaeI识别位点EagI识别位点EarI识别位点EciI识别位点EcoNI识别位点EcoO109I识别位点EcoP15I识别位点EcoRI识别位点EcoRV识别位点FatI识别位点FauI识别位点Fnu4HI识别位点FokI识别位点FseI识别位点FspI识别位点HaeII识别位点HaeIIIHgaI识别位点HhaI识别位点HincII识别位点HindIII识别位点HinfI识别位点HinP1I识别位点HpaI识别位点HpaII识别位点HphI识别位点Hpy188I识别位点Hpy188III识别位点Hpy99I识别位点HpyAV识别位点HpyCH4III识别位点HpyCH4IV HpyCH4V识别位点KasI识别位点KpnI识别位点MboI识别位点MboII识别位点MfeI识别位点MluI识别位点MlyI识别位点MmeI识别位点MnlI识别位点MscI识别位点MseI识别位点MslI识别位点MspA1I识别位点MspI识别位点MwoI识别位点NaeI识别位点NarI识别位点NciI识别位点NdeI识别位点NgoMIV识别位点NheI识别位点NlaIII识别位点NlaIV识别位点NmeAIII识别位点NotI识别位点NruI识别位点NsiI识别位点NspI识别位点PacI识别位点PaeR7I识别位点PciI识别位点PflFI识别位点PflMI识别位点PhoI识别位点PleI识别位点PmeI识别位点PmlI识别位点PpuMI识别位点PshAI识别位点PsiI识别位点PspGI识别位点PspOMI识别位点PspXI识别位点PstI识别位点PvuI识别位点PvuII识别位点RsrII识别位点SacI识别位点SacII识别位点SalI识别位点SapI识别位点Sau3AI识别位点Sau96I识别位点SbfI识别位点ScaI识别位点ScrFI识别位点SexAI识别位点SfaNI识别位点SfcI识别位点SfiI识别位点SfoI识别位点SgrAI识别位点SmaI识别位点SmlI识别位点SnaBI识别位点SpeI识别位点SphI识别位点SspI识别位点StuI识别位点StyD4I识别位点StyI识别位点SwaI识别位点TaqαI识别位点TfiI识别位点TseI识别位点Tsp45I识别位点Tsp509I识别位点TspMI识别位点TspRI识别位点Tth111I识别位点XbaI识别位点XcmI识别位点XhoI识别位点XmaI识别位点XmnI识别位点ZraI识别位点与大家共享（非原创）。

寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。

取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。

反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。

20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。

若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶酶切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，E coRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，N siI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，S peI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A2 60单位的寡核苷酸。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法（The common problems and solutions of restriction endonuclease digestion）The common problems and solutions of restriction endonuclease digestionRestriction enzyme digestion of the common problems and solutions, personally feel very well summed up, specially posted for you to share.Enzyme digestion problems, see enzyme instructions, the corresponding reagent company directory. The enzymes produced by different companies, the source of strains, the preparation process, purity, viability and enzymatic activity may be optimized differently,.Can be found in the above definition, unit of enzyme preservation conditions, enzyme system of [buffer and other enzymes such as buffer, double cut enzyme reaction temperature [some enzymes in 50, 55 or 30 temperature reaction, whether methylation affects the enzyme activity and whether there is an asterisk, asterisk may appear live factors and protective base, isocaudarner, isoschizomer1. enzymes can not be cut or incompleteThe 1.1 plasmid is the most common or poorly expressed inhibitor. The presence of miscellaneous proteins can affect enzyme digestion, showing A260/A280 below 1.8; inhibitors are common in phenols, salts, and ethanol; [re DNA, using reliable kits or reliable manual extraction reagents,1.2 enzyme problems: make sure the enzyme is effective [although many enzymes have expired time, but expired as long as the enzyme can be effectively cut, available. Make sure the enzyme is not effective. Mark it and replace it.[note] topic: by endonucleaseA. endonuclease, if no special requirement, keep -20~-30 degrees. Is not as low as possible, the enzyme is usually preserved in 50% glycerol buffer, when the temperature is too low, will freeze (enzyme transport process exception, because the enzyme requires low temperature transport, so the convenient situation is the use of dry ice, the enzyme will freeze, but the freezing times is limited, is a relatively better choice), if is often used, the enzyme will be repeated freezing and thawing, thereby reducing the activity. Of course, if the temperature is too high, ha ha, you want to go.B. enzyme should be used in ice box for enzyme extraction. It's clear to everyone, but it's no harm putting too much emphasis on it. Some of the students because the lab is put out, the enzyme in the ice box, but there are two ignored: when taking the enzyme, the hand does not hold the upper end of the pipe, and the grip at the bottom, equivalent to hand in to the enzyme by heating; some enzymes are placed in the ice box, but the absorption of the enzyme when will the enzyme take out. Once or twice a day, it can affect enzyme activity.C. enzyme should be tightened as soon as possible after the lid. Sometimes we can find that even if -20~-30 degrees are placed,the enzyme will freeze. That is because of personal reasons may be cut in the configuration when the enzyme reaction, enzyme tube lid open for a long time, glycerol will absorb moisture in the air, for large packaging commonly used enzyme sometimes arise freezing phenomenon. In addition, sometimes, because of careless operation, some of the broken ice congealed on the ice box fell into the enzyme tubes. (I appeared two times myself. SweatD. uptake of enzymes by tips. We used to take the enzyme tips is the smallest of the kind, suitable for 2ul and 10ul guns, but tips usually has two kinds, one is the most commonly used short tips, with it next to the enzyme, tips enzyme, the gun is almost to be inserted into the pipe, sometimes stained with enzyme in the gun body. Therefore, it may cause pollution. Then, we need to pay great attention to the action, or change to another long tips, specially for the enzyme solution.1.3 buffer problem. Some enzymes cut buffer, adding a number of easier to precipitate or dissolved components [ligase buffer is more like this], and sometimes when the enzyme buffer is not completely melted, the concentration of buffer is heterogeneous. The new buffer melts first, and the salt ion concentration is high. After a period of time, the concentration of the ions in the melt decreases. Normally, this has little effect, but problems arise if you use some enzymes that are sensitive to the concentration of ions.1.4 double enzyme buffer selection: make sure the correct buffer and reaction temperature are used [refer specifically to the enzyme buffer cut from the manufacturer and double enzymecut buffer, where NEB is availableHttp://www.neb-china.COM / CN /技术/重/ double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I等。

酶切位点保护碱基表：PRC引物保护碱基的设计首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。

必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。

因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。

添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶是一种能够识别并水解脱氧核苷酸侧链的蛋白质，是除磷酸双酯酶之外一类分子量比较大的酶。

这类酶不受其他限制性内切核酸酶或核酸酶的抑制，对许多蛋白质具有高度特异性。

大部分哺乳动物细胞都含有限制性内切核酸酶。

人的成熟红细胞、精子等也含有少量限制性内切核酸酶。

由于限制性内切核酸酶广泛存在于人体各组织细胞中，而且又可以对其进行高效降解，因此常被用于对细胞的活性研究。

现已知道人类有三种典型的限制性内切核酸酶：一种是位于13号染色体上的脊椎动物细胞核DNA限制性内切核酸酶;另一种是位于22号染色体上的鸟类细胞核DNA限制性内切核酸酶，以及一种位于X染色体上的人类细胞核和线粒体DNA限制性内切核酸酶。

最近，在哺乳动物细胞中发现了一种新的DNA限制性内切核酸酶。

限制性内切核酸酶对哺乳动物的DNA和RNA具有很高的专一性。

它们能识别被连接到碱基末端的核苷酸残基，并使脱氧核苷酸（或核糖核苷酸）沿着被切断的核苷酸末端彼此分开。

限制性内切核酸酶也叫做限制性核酸内切酶，是一类在某些条件下可以将DNA或RNA一分为二的特殊的核酸内切酶。

目前发现的限制性内切核酸酶包括3个亚家族，即头甲型限制性内切核酸酶、尾加型限制性内切核酸酶和未定型限制性内切核酸酶。

虽然还没有明确证据表明限制性内切核酸酶与人类癌症、基因突变、血型以及某些疾病的发生和发展有直接关系，但限制性内切核酸酶作为一类具有重要生理功能的酶，在基因工程技术的应用方面显示出巨大潜力。

与基因重组相比，基因修饰是限制性内切核酸酶作用的另一个重要领域。

因为基因修饰也是细胞中经常发生的事情。

限制性内切核酸酶的活性不仅取决于蛋白质的浓度，还取决于温度、 pH值、离子强度、金属离子、抑制剂、酶和DNA模板等多种因素，当这些因素发生变化时，限制性内切核酸酶的活性也会随之改变。

许多实验表明，不同温度和盐浓度对限制性内切核酸酶活性的影响是非常明显的，限制性内切核酸酶活性也随温度的升高而提高。

一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。

本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A26单位的寡核苷酸。

取1µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 00°C条件下分别反应2小时和20小时。

各种酶切位点的保护碱基酶切位点是指酶在DNA或RNA分子中特定的位置识别并切割的区域。

在分子生物学研究中，酶切位点的保护碱基是进行引物设计的重要参考依据之一、本文将介绍各种酶切位点的保护碱基以及在引物设计中的应用。

1.核酸酶A切割位点保护碱基核酸酶A（RNase A）是一种特定的核酸酶，能够将单链RNA切割为5'-磷酸核酸和3'-核磷酸。

核酸酶A识别和切割位点的保护碱基主要为对尿嘧啶核苷酸（Uridine，U）和鸟嘌呤核苷酸（Adenine，A）。

具体来说，核酸酶A主要作用于RNA链上U和A的周围碱基，特别是位于U或A的下一个碱基。

在引物设计中，需要考虑核酸酶A切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。

特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现U和A的保护碱基。

2.核酸酶T1切割位点保护碱基核酸酶T1（RNase T1）是一种特定的核酸酶，能够识别并切割由磷酸鸟苷（Guanosine，G）形成的RNA链。

核酸酶T1在RNA链上识别和切割位点的保护碱基为G。

具体来说，核酸酶T1主要作用于G的下一个碱基。

在引物设计中，需要考虑核酸酶T1切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。

特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现G的保护碱基。

3.限制性内切酶切割位点保护碱基限制性内切酶是一类广泛应用于DNA分子生物学研究的酶，其识别和切割DNA分子中的特定序列。

限制性内切酶识别和切割位点的保护碱基由酶自身的特异性决定。

每一种限制性内切酶都有其特定的酶切位点保护碱基要求。

一般来说，酶切位点的保护碱基主要存在于酶切位点的上下游碱基中。

在引物设计中，需要考虑限制性内切酶切割位点的保护碱基，以避免引物和酶切位点之间存在相互作用而导致切割不完全或无法切割的情况。

总而言之，在引物设计中，需要考虑各种酶切位点的保护碱基，以提高引物的特异性和稳定性。

根据不同酶的切割特点和要求，设计合适的引物序列可以避免酶切位点的保护碱基产生干扰，保证实验结果的准确性。

AatII识别位点GACGTCCTGCAGAcc65I识别位点GTMKAC CAKMTGAccI识别位点GTMKAC CAKMTGAciI识别位点CCGCGGCGAclI识别位点AACGTT TTGCAAAcuI识别位点CTGAAG GACTTCAfeI识别位点AGCGCT TCGCGAAflII识别位点CTTAAG GAATTCAflIII识别位点ACRYGT TGYRCA AgeI识别位点ACCGGT TGGCCAAhdI识别位点GACNNNNNGTC CTGNNNNNCAGAleI识别位点CACNNNNGTG GTGNNNNCACAluI识别位点AGCTTCGAAlwI识别位点GGATC CCTAGAlwNI识别位点CAGNNNCTG GTCNNNGACApaI识别位点GGGCCC CCCGGGApaLI识别位点GTGCAC CACGTGApeKI识别位点GCWGCCGWCGApoI识别位点RAATTY YTTAARAscI识别位点GGCGCGCC CCGCGCGGAseI识别位点ATTAAT TAATTAAsiSI识别位点GCGATCGC CGCTAGCGAvaI识别位点CYCGRG GRGCYCAvaII识别位点GGWCC CCWGGAvrII识别位点CCTAGG GGATCCBaeI识别位点NACNGTAYCN BamHI识别位点GGATCC CCTAGGBanI识别位点GGYRCC CCRYGGBanII识别位点GRGCYC CYCGRGBbsI识别位点GAAGAC CTTCTGBbvCI识别位点CCTCAGC GGAGTCGBbvI识别位点GCAGC CGTCGBccI识别位点CCATC GGTAGBceAI识别位点ACGGC TGCCGBcgI识别位点CGANTGN GCTNACGBciVI识别位点GTATCCCATAGGBclI识别位点TGATCAACTACTBfaI识别位点CTAGGATCBfuAI识别位点ACCTGCTGGACGBglI识别位点GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCGBglII识别位点AGATCTTCTAGABlpI识别位点GCTNAGC CGANTCGBme1580I识别位点GKGCMCCMCGKG CACGTC GTGCAGBmrI识别位点ACTGGGN TGACCCNBmtI识别位点GCTAGC CGATCGBpmI识别位点CTGGAGN GACCTCNBpu10I识别位点CCTNAGC GGANTCGBpuEI识别位点CTTGAGN GAACTCNBsaAI识别位点YACGTR RTGCAYBsaBI识别位点GATNNNNATC CTANNNNTAGBsaHI识别位点GRCGYC CYGCRGBsaI识别位点GGTCTCN CCAGAGNBsaJI识别位点CCNNGG GGNNCCBsaWI识别位点WCCGGW WGGCCWBsaXI识别位点NACNCTCCN NTGNGAGGNBseRI识别位点GAGGAGN CTCCTCNBseYI识别位点CCCAGC GGGTCGBsgI识别位点GTGCAG CACGTCBsiEI识别位点CGRYCG GCYRGC GWGCWC CWCGWGBsiWI识别位点CGTACGGCATGCBslI识别位点CCNNNNNNNGG GGNNNNNNNCCBsmAI识别位点GTCTCNCAGAGNBsmBI识别位点CGTCTCN GCAGAGNBsmFI识别位点GGGACCCCTGBsmI识别位点GAATGCN CTTACGNBsoBI识别位点CYCGRGGRGCYCBsp1286I识别位点GDGCHC CHCGDGBspCNI识别位点CTCAGN GAGTCNBspDI识别位点ATCGAT TAGCTABspEI识别位点TCCGGA AGGCCTBspHI识别位点TCATGA AGTACTBspMI识别位点ACCTGCN TGGACGNBspQI识别位点GCTCTTCN CGAGAAGNBsrBI识别位点CCGCTC GGCGAGBsrDI识别位点GCAATGNN CGTTACNN RCCGGY YGGCCRBsrGI识别位点TGTACA ACATGTBsrI识别位点ACTGGN TGACCNBssHII识别位点GCGCGC CGCGCGBssKI识别位点CCNGG GGNCCBssSI识别位点CACGAG GTGCTCBstAPI识别位点GCANNNNNTGC CGTNNNNNACGBstBI识别位点TTCGAA AAGCTTBstEII识别位点GGTNACC CCANTGGBstNI识别位点CCWGG GGWCCBstUI识别位点CGCGGCGCBstXI识别位点CCANNNNNNTGG GGTNNNNNNACCBstYI识别位点RGATCY YCTAGRBstZ17I识别位点GTATAC CATATGBsu36I识别位点CCTNAGG GGANTCCBtgI识别位点CCRYGG GGYRCCBtgZI识别位点GCGATG CGCTAC GCAGTGNN CGTCACNNBtsI识别位点GCAGTGNN CGTCACNNCac8I识别位点GCNNGC CGNNCGClaI识别位点ATCGAT TAGCTACspCI识别位点NCAANGTGGN NGTTNCACCNCviAII识别位点CATGGTACCviKI-1识别位点RGCYYCGRCviQI识别位点GTACCATGDdeI识别位点CTNAGGANTCDpnI识别位点GATCCTAGDpnII识别位点GATCCTAGDraI识别位点TTTAAA AAATTTDraIII识别位点CACNNNGTG GTGNNNCACDrdI识别位点GACNNNNNNGTC CTGNNNNNNCAGEaeI识别位点YGGCCR RCCGGYEagI识别位点CGGCCG GCCGGCEarI识别位点CTCTTC GAGAAG EciI识别位点GGCGGACCGCCTEcoNI识别位点CCTNNNNNAGG GGANNNNNTCCEcoO109I识别位点RGGNCCY YCCNGGREcoP15I识别位点CAGCAGGTCGTCEcoRI识别位点GAATTCCTTAAGEcoRV识别位点GATATCCTATAGFatI识别位点CATGGTACFauI识别位点CCCGCGGGCGFnu4HI识别位点GCNGCCGBCGFokI识别位点GGATGN CCTACNFseI识别位点GGCCGGCC CCGGCCGGFspI识别位点TGCGCA ACGCGTHaeII识别位点RGCGCY YCGCGRHaeIIIHgaI识别位点GACGCCTGCGHhaI识别位点GCGCCGCGHincII识别位点GTYRAC CARYTG HindIII识别位点AAGCTTTTCGAAHinfI识别位点GANTCCTNAGHinP1I识别位点GCGCCGCGHpaI识别位点GTTAACCAATTGHpaII识别位点CCGGGGCCHphI识别位点GGTGACCACTHpy188I识别位点TCNGAAGNCTHpy188III识别位点TCNNGAAGNNCTHpy99I识别位点CGWCGGCWGCHpyAV识别位点CCTTCGGAAGHpyCH4III识别位点ACNGTTGCCAHpyCH4IV HpyCH4V识别位点TGCAACGTKasI识别位点GGCGCCCCGCGGKpnI识别位点GGTACCCCATGGMboI识别位点GATCCTAGMboII识别位点GAAGACTTCTMfeI识别位点CAATTGGTTAAC ACGCGT TGCGCAMlyI识别位点GAGTCCTCAGMmeI识别位点TCCRAC AGGYTGMnlI识别位点CCTCGGAGMscI识别位点TGGCCA ACCGGTMseI识别位点TTAAAATTMslI识别位点CAYNNNNRTG GTRNNNNYACMspA1I识别位点CMGCKG GKCGMCMspI识别位点CCGGGGCCMwoI识别位点GCNNNNNNNGC CGNNNNNNNCGNaeI识别位点GCCGC CGGCCGNarI识别位点GGCGCC CCGCGGNciI识别位点CCSGGGGSCCNcoI识别位点CCATGG GGTACCNdeI识别位点CATATG GTATACNgoMIV识别位点GCCGGC CGGCCGNheI识别位点GCTAGC CGATCG CATGGTACNlaIV识别位点GGNNCC CCNNGGNmeAIII识别位点GCCGAG CGGCTCNotI识别位点GCGGCCGC CGCCGGCGNruI识别位点TCGCGA AGCGCTNsiI识别位点ATGCATTACGTANspI识别位点RCATGYYGTACRPacI识别位点TTAATTAA AATTAATTPaeR7I识别位点CTCGAG GAGCTCPciI识别位点ACATGT TGTACAPflFI识别位点GACNNNGTC CTGNNNCAGPflMI识别位点CCANNNNNTGG GGTNNNNNACCPhoI识别位点GGCCPleI识别位点GAGTCN CTCAGNPmeI识别位点GTTTAAAC CAAATTTGPmlI识别位点CACGTG GTGCACPpuMI识别位点RGGWCCY YCCWGGR GACNNNNGTC CTGNNNNCAGPsiI识别位点TTATAAAATATTPspGI识别位点CCWGG GGWCCPspOMI识别位点GGGCCC CCCGGGPspXI识别位点VCTCGAGB BGAGCTCVPstI识别位点CTGCAG GACGTCPvuI识别位点CGATCG GCTAGCPvuII识别位点CAGCTG GTCGACRsaI识别位点GTACCATGRsrII识别位点CGGWCCG GCCWGGCSacI识别位点GAGCTC CTCGAGSacII识别位点CCGCGG GGCGCCSalI识别位点GTCGAC CAGCTGSapI识别位点GCTCTTCN CGAGAAGNSau3AI识别位点GATCCTAGSau96I识别位点GGNCC CCNGGSbfI识别位点CCTGCAGG GGACGTCC AGTACTTCATGAScrFI识别位点CCNGGGGNCCSexAI识别位点ACCWGGT TGGWCCASfaNI识别位点GCATCN CGTAGNSfcI识别位点CTRYAG GAYRTCSfiI识别位点GGCCNNNNNGGCC CCGGNNNNNCCGGSfoI识别位点GGCGCC CCGCGGSgrAI识别位点CRCCGGYG GYGGCCRCSmaI识别位点CCCGGG GGGCCCSmlI识别位点CTYRAG GARYTCSnaBI识别位点TACGTA ATGCATSpeI识别位点ACTAGT TGATCASphI识别位点GCATGC CGTACGSspI识别位点AATATT TTATAAStuI识别位点AGGCCT TCCGGAStyD4I识别位点CCNGG GGNCCStyI识别位点GCWWGG GGWWCCSwaI识别位点ATTTAAAT TAAATTTATaqαI识别位点TCGAAGCTTfiI识别位点GAWTCCTWAGTliI识别位点CTCGAG GAGCTCTseI识别位点GCWGCCGWCGTsp45I识别位点GTSACCASTGTsp509I识别位点AATTTTAATspMI识别位点CCCGGG GGGCCCTspRI识别位点NNCASTGNN NNGTSACNNTth111I识别位点GACNNNGTC CTGNNNCAGXbaI识别位点TCTAGAAGATCTXcmI识别位点CCANNNNNNNNNTGG GGTNNNNNNNNNACCXhoI识别位点CTCGAGGAGCTCXmaI识别位点CCCGGGGGGCCCXmnI识别位点GAANNNNTTC CTTNNNNAAGZraI识别位点GACGTCCTGCAG与大家共享〔非原创〕。

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。