限制性内切酶原理ppt课件

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4.1.1 限制性内切酶

限制性内切酶LOGOE. coli KE. coli C EOP=1EOP=1EOP=1EOP=10-4E.coli K E.coli B E.coli CλC11110-410-410-410-411λK λB1963年以来，Arber及其同事发现，经同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随着其DNA的降解，但宿主自身的DNA不被降解。

Arber的解释：通过噬菌体感染进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰而免于被分解。

1965 年，Arber预言有限制性内切酶的存在发现1968年Messelson首次从E.coli K中分离限制性内切酶 Eco K①需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等②有特定的识别位点，但没有特定的切割位点③切割位点远离识别位点1000bp以上1970年美国约翰·霍布金斯大学 H.Smith 偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）细胞提取液能迅速降解外源的噬菌体DNA ，但不能降解自身DNA ，这就是Hin dII酶。

Nathans等人立即查明了限制内切酶的有效性，并将其用来分析 DNA 的结构。

1978 H.Smith， W Arber和D Nathans由于限制性内切酶发现和应用的研究得到诺贝尔奖。

命名限制酶的命名最初由Smith和Nathans于1973年提出，1980年再由Roberts进行系统化和分类，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。

1、来源菌属名的首字母和其种名的头两个字母形成的三个字母缩写来表示。

2、用一个字母表示菌株或类型。

3、用罗马字母表示不同的限制与修饰体系。

如Eco RI（Escherichia coli ）种类根据限制酶识别切割特性，催化条件，及是否有修饰酶活性分三类(I, II ,III) 。

也有分四类，IIs类，即II 亚类。

type Ⅰ（数量少，约占1%）特点：（1）属复合酶类，兼具修饰和切割DNA两种特性。

限制性内切酶的应用PPT课件

CHENLI
9
II型限制性内切酶的分类（一）
❖ 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I
这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成
商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫
他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与
DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序
列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这
些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切
开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
CHENLI
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一些概念
❖ 粘末端和平末端 ❖ 同尾酶 ❖ 同裂酶 ❖ 同识异切酶 ❖ 消化 ❖ 星号活力
氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。
CHENLI
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II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
❖ 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻找更多的限制性内切酶
CHENLI
2
限制性内切酶的特点
❖ 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大

限制性内切酶ppt

限制性内切酶
细菌可以抵御病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
一、限制-修饰现象的发现
表1
从表1可看出，从三种不同的E.coli菌株中繁殖出来的λ噬菌体的后代(分别用λK、λ B 、 λC表示)，再接种到同样菌株，接种效率都是 1。
但如果接种到不同的菌株中，如λK在B株上接种效率只有10-4，而不管λK还是λB在C株上的接种效率都为1。
Answer: 幸存者的后代因为有新寄主的修饰标记而缺少祖代寄主的修饰标记，只能感染新的寄主类型，而不再能感染祖代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质粒和噬菌体。
host restriciton enzymes.
Once methylated however, all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemimethylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction.
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。
对表1的解释：
不同的菌株可能有不同的限制修饰系统。当不同来源的噬菌体λ进入另一种大肠杆菌时，绝大部分被限制酶所降解，但有极少数的入噬菌体先被大肠杆菌的甲基化酶所修饰，因而幸存下来.

限制性内切酶原理PPT.

AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
小提示24：申请表为每个应聘者提供了同等的竞赛场地。
如45．’你同N意，N我G们应C将聘把者G你工G的作C资变料动C存是G档否，合C以情N备合来理N日。3之‘需。（询问应聘者5是’否同N意N将N其G资料C存-O档。H）
限制性内切酶原理
限制酶
II型限制酶
1
限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。
限制性核酸内切酶
分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。
II型限制酶所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名种名株系编号
切割频率
切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。
前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。

工具酶(限制性内切酶)优秀PPT

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Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
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某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
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Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
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• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小，亚基约 200-350 个氨基酸。
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某些识别和切割独特的酶
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限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系的一个简化版。其主要特征是：

限制性内切酶.正式版PPT文档

回文序列 • 5'......GAA TTC......3' • 3'......CTT AAG......5'
• 从两侧读都是核苷酸的序列都是5'-GAATTC-3'
限制性内切酶的命名
• 限制性核酸内切酶的命名最早由 ห้องสมุดไป่ตู้mith 等1973 年提出,。
• 1980 年 Robert s 进行系统化和分类。
同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的。它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行末
端连接。以下几种酶产生的末端是相同的· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
限制性内切酶的切割方式
影响限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型酶对DNA序列的识别一般具有以下几个特征
①大多数酶的识别序列很严格，少有变动的余地
②识别序列的碱基数一般为4~8对，一般都富含C和G. ③大多数识别位点具有180度旋转对称的回文序列，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读都完全相同。
④识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割效果
限制性内切酶
主要内容 • 限制性内切酶的概念 • 限制性内切酶图谱 • 限制性内切酶的图谱分析法
限制性内切酶
是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧核糖核酸酶，限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点

《生物选修三》PPT课件

A.BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列-AATTB.BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列-GATCC.EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列-AATTD.BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列-GATC-
【解题关键】首先要明确不同的限制酶有特定的识别序列，其次要分析切割下的黏性末端能否互补，另外要注意互补序列的正确书写。
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ppt课件
【典例3】(2010·江苏高考改造)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
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ppt课件
(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有 ____个游离的磷酸基团。 (2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越_____。
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ppt课件
3.载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型环状DNA，有的细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些病毒的DNA。一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。
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ppt课件
①最常用的载体是质粒，它来源于细菌和酵母菌等生物，其上的基因属于细胞质基因。它能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞复制，也可在体外复制。 ②主动运输中载体蛋白的化学本质是蛋白质，其作用是运输离子、氨基酸、核苷酸等物质进出细胞。而基因工程中的载体的化学本质是DNA，其作用是携带目的基因进入受体细胞。
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ppt课件
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ 切割，原因是_____________________________________。 (4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_______。 (5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_____酶。

限制性酶切与连接PPT课件

• 质粒pUC18 DNA • PCR产物 • HindⅢ内切酶 • Hind Ⅲ 10 X buffer • ddH2O
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
保存
DNA电泳常见问题分析问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力；内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。

限制性内切酶原理42页PPT

限制性内切酶原理
21、没有人陪你走一辈子，所以你要适应孤独，没有人会帮你一辈子，所以你要奋斗一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该是坚强。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之首，因为这种德性保证了所有其余的德性。--温斯顿．丘吉尔。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的，它只是让人们的脚放上一段时间，以便让别一只脚能够再往上登。
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的4、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利

限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件

ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则：第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名第二、三个字母（小写）：该细胞的种名第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
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限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶：在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株
5. 换用不同切割非甲基化位点的同类酶消化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要

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5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
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同裂酶
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。 XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但 Xma I的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而Sma I的切点则在CCC^GGG，形成平末端。
3’粘性末端
5’NNGGTACCNN3‘ 3’NNCCATGGNN 5 ‘
5’NNGGTAC-OH P-CNN3‘ 3’NNC-P HO-CATGGNN 5 ‘
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同尾酶
切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ Bcl I Xho Ⅱ
AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
12
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
5’NNGCGGCCGC NN3‘ 3’NNCGCCGGCGNN 5 ‘
5’NNNGC-OH P-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ‘
II型限制酶所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
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什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
5
命名 Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名种名株系编号
6
切割频率
切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。
前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。
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DNA的纯度
限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、 SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。
提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法：
①增加限制酶的用量。 ②扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释） ③延长酶催化反应的保温时间。
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前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。
1
2
1 限制酶的定义
2 限制酶的种类
II型限制酶
3 Ⅱ型限制酶的应用
4 DNA甲基化酶
1
限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。
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限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。
如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为 n个 bp，则其切割频率为（1/4）n 。
7
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2
限制酶的种类
I型限制酶通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能
准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。
GAATATTC CTTATAAG
II型限制酶 ApaI BamHI BglII EcoRI HindIII KpnI NcoI NdeI NheI NotI SacI SalI SphI XbaI XhoI
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识别序列： 5'GGGCC^C 3' 识别序列： 5' G^GATCC 3' 识别序列： 5' A^GATCT 3' 识别序列： 5' G^AATTC 3' 识别序列： 5' A^AGCTT 3' 识别序列： 5' GGTAC^C 3' 识别序列： 5' C^CATGG 3' 识别序列： 5' CA^TATG 3' 识别序列： 5' G^CTAGC 3' 识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' 识别序列： 5' GAGCT^C 3' 识别序列： 5' G^TCGAC 3' 识别序列： 5' GCATG^C 3' 识别序列： 5' T^CTAGA 3' 识别序列： 5' C^TCGAG 3'
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粘性末端和平末端
II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。
5’NNNGTTAACNNN3‘
3’NNNCAATTGNNN5‘
5’NNNGCGGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGGCGNNN 5 ‘
5’NNNGTT 3‘NNNCAA
特殊的II型限制酶
有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
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影响限制性酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）