第一节 工具酶(限制性内切酶)

Байду номын сангаас
某些识别和切割独特的酶
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 由于发现了大量的限制和修饰酶， 一的命名体系。 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 （ ） 了一个合适的体系， 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是： 的一个简化版。其主要特征是：
限制和修饰现象
• 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 （ ） 性内切酶时达到高峰。 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是， 内切酶不具备人们希望的性质。 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机” 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。 ）。
限制性内切酶命名
• 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。 ① 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。微生物属 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母, ② 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶， 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶，依发现和分离的前 后顺序用罗马数字区分。 后顺序用罗马数字区分。 限制性内切酶名称的前三个字母用斜体表示，后面的字母、 ③ 限制性内切酶名称的前三个字母用斜体表示，后面的字母、罗马数字等均 为正体。同时，字母之间、罗马数字与前面的字母之间不应有空格(由于在现 为正体。同时，字母之间、罗马数字与前面的字母之间不应有空格 由于在现 有的大多数软件排版时， 有的大多数软件排版时，当输入罗马数字时其会自动与前面的字母之间拉开 半个汉字的空格， 半个汉字的空格，故在印刷体的书刊中就会看到罗马数字与前面的字母之间 有空格)。 有空格 。
一、工具酶
• 到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制 年代中期， 和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣 的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁 ），但是谁 的现象（ ， ）， 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 限制酶 呢？ • 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？ 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？ 限制酶
粘性末端的意义
• 限制性核酸内切酶通常可产生两种不同的粘 性末端，一种是形成带有凸出的 ′ 性末端，一种是形成带有凸出的5′磷酸基 团的粘性末端， 团的粘性末端，如EcoRⅠ；另一种形成带有 Ⅰ 凸出的3′羟基基团的粘性末端， 凸出的 ′羟基基团的粘性末端，如PstⅠ。 Ⅰ
同裂酶和新裂酶
• 偶尔人们会发现识别新的特异性 DNA 序列 的酶， 的酶，但已经证明大部分酶的特异性都与已 知的酶相同。 知的酶相同。具有相同的序列特异性和切割 位点的限制酶称为同裂酶 同裂酶。 位点的限制酶称为同裂酶。 • 识别相同序列，但切割位点不同的酶，例如 识别相同序列，但切割位点不同的酶， SmaⅠ（CCC/GGG）和 XmaⅠ Ⅰ ） Ⅰ ），有时称为新裂酶。 （C/CCGGG），有时称为新裂酶。 ），有时称为新裂酶
酶的星号活性
• 在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限 在极端的条件下（ 和低离子强度下），限 ）， 制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。 星号活性 • 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列 中碱基的缺失。例如， 中碱基的缺失。例如，EcoR Ⅰ（EcoR Ⅰ星号活 为任意碱基， 性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而 ， EcoR Ⅰ切割序列为 GAATTC。 。
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带， 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 分析和克隆的限制性内切酶。 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。 分析和克隆的限制性内切酶 2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。 3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列； 序列； 4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性， 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
FokI
Ⅲ 型限制性内切酶
• 也是一类较大的兼有限制 修饰两种功能的酶。 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。 修饰两种功能的酶 它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要 求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列 分子中存在两个反向的识别序列 以完成切割。 以完成切割。 • 这类酶很少能达到完全切割。 这类酶很少能达到完全切割。
Ⅱ型限制内切酶的发现
的发现， 突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 ） 中找到了一种限制性内切酶 ），并阐明了它在噬菌体 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 ， ）， 核苷酸序列（ ）。这个酶现在命名为 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。 ， ）。 嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ 而且含量很大。 嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是， 不切割T7 运的是，Hind Ⅲ不切割 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 ， Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。 将不产生任何问题（ ）。 在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 Ⅱ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶， 析了它们的性质， 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， Ⅰ是其中最重要的一个（ 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。 ）。它们随即迅速用于最初的重组 实验中。 ）。
另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
• 所谓的Ⅱ 型酶， 所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大 ， 。 小居中， 个氨基酸， 的功能域组成。 小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。 它们识别连续的非对称序列。 它们识别连续的非对称序列。 • 一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能 域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多个识别位 域结合成二聚体， 链 因此一些Ⅱ 分子时活性更高。 点的 DNA 分子时活性更高。
某些识别和切割独特的酶
BsmBⅠ
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. 。 coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。 系统为代表。
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 羟基和一 磷酸基。 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 磷酸基 只有当镁离子存在时， 才有切割活性， 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 个氨基酸。 亚基约 200-350 个氨基酸。
Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 • 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有， 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义， 究中很有意义，但其不 • 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带， 而不具备实用性。 而不具备实用性。
同尾酶
同尾酶是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异， 同尾酶是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异， 识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 常用的限 制 酶 BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、Sau3AⅠ、 Ⅰ Ⅱ Ⅰ Ⅰ XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割 DNA之后都形成由 DNA之后都形成由 之后都形成由GATC Ⅱ就是一组同尾酶， 个核苷酸组成的粘性末端。显而易见， 4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶产生的 DNA 片段， 片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起 来的,因此在基因工程操作中很有用处。 来的,因此在基因工程操作中很有用处。 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点， 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特 称之“杂种位点”但这类杂种位点形成之后， 称之“杂种位点”但这类杂种位点形成之后，一般不能再被 原来的任何一种同尾酶所识别。 原来的任何一种同尾酶所识别。
限制和修饰（ 限制和修饰（R -M ）的类型至少存在 4 种不同类型的 R M 系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结 系统：类型Ⅰ 在表 3.1 中。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，
传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内 切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。