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生物技术通讯LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．21No．3May,2010 doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2010．03．027技术方法不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响陈志胜，王丙云，黄文静，陈胜锋，计慧琴佛山科学技术学院动物医学系，广东佛山528231［摘要］目的：为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件，比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。
方法：用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞，经丝裂霉素处理后制作饲养层，比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。
结果：在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中，鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态，而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著（P＞0．05）。
结论：鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。
［关键词］鸡胚胎干细胞；饲养层；鸡胚成纤维细胞；鸭胚成纤维细胞［中图分类号］Q813［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2010)03－0416－03Effects of Different Feeders on Cultured Chicken Embryonic Stem CellsCHEN Zhi－Sheng,WANG Bing－Yun,HUANG Wen－Jing,CHEN Sheng－Feng,JI Hui－Qin Department of Veterinary,Foshan University,Foshan528231,China［Abstract］Objective:To research the optimal culture condition of chicken embryonic stem cells,compare the effect of different feeders on cultured chicken embryonic stem cells in vitro．Methods:The second generation chicken embryonic fibroblast(CEF)and duck embryonic fibroblast(DEF)were used to make feeders after treated with mitomycin C．The state of chicken embryonic stem cells were observed and the number of cell clones was countedon the culture system with those two feeder layers or feeder layer free．Results:The results showed that chicken embryonic stem cells growth well both on the CEF and DEF feeder,and the number of cell clones was no distinct difference between CEF and DEF(P＞0．05)．Conclusion:The results indicated that both of CEF and DEF can be used as feeders to culture chicken embryonic stem cells．［Key words］chicken embryonic stem cells;feeder;chicken embryonic fibroblast;duck embryonic fibroblast胚胎干细胞离体培养技术的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，采用饲养层培养胚胎干细胞，是实现这一目标最有效的方法之一[1－2]。
-316-安徽医科大学学报Ada UnWersitatie Medicinalie AnOut242)Mgy；56(5)网络出版时间：242)-4-25：5网络出版地址：https：//k/kP cet/kcms/d eWiU34.1465.R.04012440.1342428.html ◊技术与方法◊大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定周正炜,郭派派,王曼曼,孙寒飞,王珍,邰宇,刘琪,张巧琳,吴华勋,汪庆童,魏伟摘要探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法。
采用4.175%胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞。
高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力，免疫荧光、Western UU-和RTWCR法检测波形蛋白表达水平,CD94标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度。
最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰，单个散在或聚集成团分布,94 mu后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展。
5~6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形。
波形蛋白表达呈强阳性。
传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87%。
含5%FBS的DMEM/F5培养基培养24h 即可检测到细胞的大量增殖。
胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法。
关键词大鼠乳鼠;颌下腺成纤维细胞;原代培养;胰酶消化法；波形蛋白中图分类号R593.2文献标志码A文章编号504-592(242))45-0814-46 doi：14.19445/kh iss/1204-1492.242245.450多种疾病可引起唾液腺功能减退，典型代表为干燥综合征(SjoguC s sypdumv,SS),目前尚无有效的治疗药物［］。
已有研究S3表明，唾液腺中的成纤维细胞异常活化，产生大量胶原,引起唾液腺发生纤维化是SS患者唾液腺功能损伤，唾液分泌量减少的重要病理机制。
因此对唾液腺成纤维细胞功能异常的发生机制、细胞功能改善方法的研究有助于深入理解SS病理机制和寻找有效的治疗手段。
小鼠滑膜成纤维细胞的原代培养赵进军;胡子有;欧阳晴晴;毋静;陈玉姣;杨敏【摘要】Objective The primary culture of synovial fibroblasts is a convenient tool to study the pathology and physiology of synovialtissues .An improved method was constructed in this study by C57BL /6 mice to study the mechanism of rheumatoid ar-thritis(RA) .Methods The synovium around the hip joints were collected .Attention should be paid to eliminate the "egg-yolk" like yellow oval substance in the middle of the synovium .The synovium was transferred into a 1 .5 mL Eppendorf tube containing 0 .5%type Ⅳ collagenase and cut into 1 mm3 blocks or so .The Eppendorf tube was placed in 37 ℃ Constant temperature orbital shaker incubator for 60 min .After digestion ,the tube was placed on the Vortexfor a high-speed oscillation for 1 .5 minutes to guarantee the separation of cells .Results Within about 1 week ,the first passage was performed by the trypsin digestion method .On day 10 , the number of synovial macrophages reached the maximum and then decreased gradually .After the third generation (day 15 to 20) , the synovial macrophages generally disappeared .Vimentin was suitable for the immunofluorescence cytochemical staining for the synovial fibroblasts .The cell purity was indicated as > 95% .The cytometric analysis indicated that purity of Vimentin and CD90 .2-labelled cells was over 95% ;the purity of CD54-labelled cells was 80% approximately .Conclusion It is a simple and effective method for primary culture of synovial fibroblasts in mice .%目的：利用 C57BL ／6小鼠探索出一种改良的小鼠滑膜成纤维细胞（SF）的原代培养方法，以方便类风湿关节炎（RA）关于滑膜炎的研究。
北京鸭肝间充质干细胞分离、培养及分化潜能研究李婷婷; 许龙; 梁峻【期刊名称】《《中国畜牧兽医》》【年(卷),期】2019(046)010【总页数】8页(P2882-2889)【关键词】北京鸭; 间充质干细胞; 生物学特性; 诱导分化; 肝脏【作者】李婷婷; 许龙; 梁峻【作者单位】佳木斯大学生命科学学院佳木斯154007; 佳木斯大学基础医学院佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】S852.16+5北京鸭至今已有400多年的历史，是世界著名的肉用型标准品种，现在国际上许多著名的肉用鸭品种都含有北京鸭的血统，如丽佳鸭、樱桃谷鸭、奥白星鸭、枫叶鸭等。
肝脏内含有多种类型的干细胞，如肝间充质干细胞(liver mesenchymal stem cells,LMSCs)、肝干细胞(liver stem cells,LSCs)、肝上皮样祖细胞(liver epithelioid progenitor cells,LESCs)等。
肝干细胞或肝间充质干细胞形态为细长的纺锤形和卵球形核，并具有间充质干细胞特性[1]。
LMSCs是肝母细胞的前体，在体外可分化为肝母细胞，移植体内后可分化为肝干细胞[2]。
LMSCs是双潜能细胞，可分化为肝细胞和胆管细胞，是最广泛研究的干细胞之一。
无论是胎儿还是成体的LMSCs都可以进行长期体外培养[3]。
LMSCs因其在体外和体内的肝分化潜能，在肝脏修复中发挥着重要作用。
尽管对人和鼠类的LMSCs生物学特性进行了许多研究，但从鸭胚中分离LMSCs鲜有报道。
目前，对于LMSCs分离培养大致采用两种方法：组织块贴壁培养法和酶消化培养法，研究者多采用酶消化培养法[4-6]。
本试验以北京鸭为研究对象，通过酶消化培养法分离纯化LMSCs，在体外建立稳定的扩增与诱导体系，可作为物种保存的种子细胞为以后基因改良提供参考。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验动物 19日龄健康北京鸭鸭胚由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平实验基地种禽场提供。
2012年第34卷第13期ChinaPoultryVol.34，No.13.2012实验研究
收稿日期：2012-01-04修回日期：2012-02-20∗基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NY⁃
CYTX-45-02）；浙江省农科院科技创新能力提升工程∗∗通讯作者，E-mail：well-being365@163.com
鸭胚成纤维细胞培养鸭胚成纤维细胞培养、、传代及保存方法的研究∗
许静1，2，李进军1∗∗，熊胜1，陈黎1，杨倩2，卢立志1（1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；2.南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）
摘要：本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系，为鸭胚胎或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织，10%FBS+DEME营养液培养，获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护剂对F1
代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存，检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获
得高活性的鸭胚成纤维细胞，并可成功传至第三代。其中F1代与F2
代细胞活力最好，达到
90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异，均小于80%，其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强，生长密度保持较好。关键词：鸭胚成纤维细胞；体外培养；冷冻保存；细胞活力
Culture，SubcultureandCryopreservationofEmbryoFibroblastofDuck∗
XUJing1，2，LIJinjun1∗∗，XIONGSheng1，CHENLi1，YANGQian2，LULizhi1
（1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou，Zhejiang310021；
2.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing，Jiangsu210095）
Abstract：Effectivemethodsforisolation，culture，subcultureandcryopreservationofduckembryofibroblastinvitrowasestablishedwhichwouldlaythefoundationforcultureofembryoorgermstemcells.Theduckembryonaltissuewasdigestedwithtrypsin-EDTAtoobtainprimarycellsandpassagecells，whichwereculturedwith10%FBS+DEME.UsetheDMSO，glycerin，ethyleneglycolascryoprotectantstofreezeF1cells，andobservethecellviabilityofanabioticcells.Themethodscouldbeusedforisolationandpurecultureofduckembryofibroblastinvitro，andcouldbesubculturedtothethirdgeneration.TheresultsindicatedthatthecellviabilityinF1andF2cameupto90%，butnosignificantdifferencewasobserved.Thecellviabilityofallanabioticcellsdecreased（<80%）aftercryostoragedbythreedifferentcryoprotectants.DMSOwasthemosteffectivereagentforcryopreservationofduckembryofibroblast.Keywords：duckembryofibroblast；cultureinvitro；cryopreservation；cellviability
--92012年第34卷第13期ChinaPoultryVol.34，No.13.2012实验研究
我国是养鸭大国，饲养量居世界第一位。联合国粮食及农业组织（FAO）最新统计数据显示，当前我国鸭存栏量超过7.25亿只，占世界总存栏量的72%左右，可见养鸭业在我国国民经济中占有重要的地位。同时，我国也是世界鸭种资源最为丰富的国家，一些地方品种拥有如体型小、产蛋多、耗料省、成熟早、适应性强等优点［1］。若能利用转基因技术将各品种种质优势拓展到其它鸭种中，必将大大加快鸭的育种进程。近年来利用动物胚胎或生殖干细胞培育转基因动物已成为国内外动物转基因研究工作的热点。研究表明，实现动物胚胎或生殖干细胞离体培养的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，而且采用同一物种来源的饲养层细胞来培养胚胎或生殖干细胞，是实现这一目标最有效的方法之一［2，3］。如有研究表明，由于鸡成纤维细胞与鸡胚胎干细胞具有同源性，因此鸡成纤维细胞可作为后者建系首选的饲养层细胞［4］。由此推理，建立成熟的鸭胚成纤维细胞培养体系将有助于高效培养鸭胚胎或生殖干细胞。现有文献［5］报道原代及继代鸭胚成纤维细胞制备的方法，但关于建立鸭胚成纤维细胞的原代培养、继代培养以及冷冻复苏体系的研究报道却比较少。鉴于此，本试验拟建立鸭胚成纤维细胞的体外培养和冷冻保存体系，旨在为后续鸭胚胎或生殖干细胞的体外培养奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物10~12日龄绍兴鸭鸭胚。1.1.2主要试剂无支原体胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；青、链霉素混合液购自凯基生物有限公司；D-PBS（1×）、0.25%Trypsin&0.02%EDTA、DMEM高糖培养液（1×）均购自吉诺生物医药技术有限公司；DMSO购自美国Sigma公司；甘油购自上海德恒生物技术有限公司；乙二醇购自无锡市晶科化工有限公司。1.2试验方法1.2.1原代鸭胚成纤维细胞制备取10~12日龄鸭胚，照蛋挑选活胚，用碘酒、酒精消毒蛋壳；去壳取鸭胚，放入无菌平皿中，去头、四肢及内脏；将取得的胚体放入小烧杯中，用PBS清洗3次，后转入另一带纱布的小烧杯中；
用大剪刀剪碎胚体，再用PBS清洗3次，去上层混液，洗去血污；加入胰酶，先润洗胚体一次以达到胰酶的浓度，再加入胚体体积的4~5倍量（6~7mL）置入三角锥形瓶中，37℃、5%CO2
、饱
和湿度条件下培养箱中消化10min，待液体浑浊后收集上层细胞悬液置离心管中，冰浴；再次加入胰酶，37℃、5%CO2
培养箱二次消化8min取上
层细胞液于离心管中；离心1000~1500r/min，3~5min将细胞离心至管底，去上清；收集的细胞
用PBS清洗离心去上层液3次；加入含有10%胎牛血清的DMEM生长培养基，吹打细胞，8层纱布过滤；细胞计数，加入DMEM稀释细胞浓度为3×105~5×105个/mL为宜；将稀释好的细胞液加入
到干净的培养瓶中进行培养，37℃、5%CO2
、饱和
湿度下培养，及时观察细胞贴壁情况。细胞贴壁后大概6h后进行换液，去除死细胞，细胞进入增殖期后可用维持液（含4%血清的DMEM培养基）进行换液，进入静止期前需要传代；观察细胞生长情况，及时记录观察情况。1.2.2细胞传代
原代培养的细胞80%~90%铺满培养瓶底部时，即可进行传代；吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液进行消
化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用移液管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min，去上清，收集细胞沉淀；加
入5mL左右培养基进行吹打，吸取20~50μL细胞液加入台盼蓝染色，在计数板上进行细胞计数；用含10%小牛血清的DMEM培养液重新悬浮细胞并计算细胞密度，以3×105个/mL接种到培养瓶中，在37.5℃、5%CO2
、饱和湿度条件下的培养箱
中培养。待细胞贴合度达到80%~90%时用同样的方法继续传代。1.2.3细胞冷冻
培养的细胞生长到对数生长期时即可进行--102012年第34卷第13期ChinaPoultryVol.34，No.13.2012实验研究
细胞冷冻；吸出原培养液，然后用PBS清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用吸管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min，去上清，收集细胞沉淀；分别用3种不同的冷冻液（10%DMSO/甘油/乙二醇+20%血清+70%DMEM）重悬细胞，反复吹打，吹打成单个细胞，保持细胞密度为1×106~2×106个/mL装入冷冻管中；4℃保存2h，冰水中保存30min，-20℃保存1h，-30℃保存1h，-70℃过夜，第2天放入液氮保存。1.2.4细胞复苏液氮中冻存7d后，取出冷冻管，立即投入37℃水浴中，并迅速在水浴中晃动，约2/3融解时即可从水浴中取出，并继续晃动使其完全融解；细胞融解后，用含10%血清的DMEM培养液将细胞稀释至原体积的4倍，这个过程完成要迅速，控制在5min之内；低速离心：300r/min离心5min；500r/min离心3min。去上清，加培养液；用0.5%的台盼蓝染色液于倒置显微镜下观察计数。透亮而不着色的为活细胞，染成蓝色的为死细胞；稀释细胞至3×105~5×105个/mL加入培养瓶中进行培养。1.2.5细胞活力检测每两天传代一次，每次传代3个25cm2细胞瓶；用台盼蓝试剂染色观察活细胞和死细胞数量，计算细胞活率。1.3统计分析方法运用SPSS16.0软件进行数据处理和差异显著性（P<0.05）分析。2结果与分析2.1鸭胚原代成纤维细胞培养的生长情况和形态特征采用酶消化法获得原代细胞，接种置25cm2培养瓶，1~2h后90%以上细胞已经贴壁，且贴壁牢靠，12h后活的成纤维细胞均能正常贴壁并进行伸展，部分没有触及细胞瓶底部的细胞24h后死亡，游离于培养液上，呈球形颗粒状。在倒置显微镜下观察发现细胞呈长梭形向两侧伸展，有两个触角，细胞透亮有立体感，但杂细胞比较多（见图1A、1B）。一般混有上皮细胞，呈不规则状生长，有多个触角，需进行纯化。由于成纤维细胞在消化时首先脱落，传代后贴壁速度快，而上皮细胞由于在短时间内不能贴壁或者附着不稳，轻微振动即脱落，由此可以达到传代纯化的目的。原代细胞的活力为82.90%，在24h之内细胞活性较好，可进行传代。2.2传代细胞培养的生长情况和形态特征
