脂肪干细胞原代培养流程

脂肪干细胞制备
1、准备手术器械，进行严格消毒处理。

2、在手术过程中，医生将通过局部麻醉药对抽脂部位进行麻醉。

3、使用注射器将肿胀液（含有局麻药和生理盐水的混合物）注射
到脂肪层中。

4、使用吸引器将脂肪组织吸取出来，并将其收集在一个容器中。

5、对收集到的脂肪组织进行过滤和清洗，以去除其中的血液、肿
胀液和杂质。

6、将处理后的脂肪组织中的单个细胞分离出来，并将其培养在特
定的培养基中。

7、在培养基中添加一些生长因子和营养物质，以促进脂肪干细胞
的增殖和分化。

8、培养过程中需要进行多次换液和清洗，以确保细胞的健康生长。

9、在培养过程中，脂肪干细胞将逐渐增殖并分化成不同类型的细
胞，如成纤维细胞、内皮细胞和神经细胞等。

10、最后，将培养好的脂肪干细胞进行冷冻保存，以备后续使用。

红色的是参考同类实验所用的方法，比例，不知道在我们实验室可行不，黄色是疑问的地方，希望老师解答下谢谢一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。

取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM 重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。

镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。

细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。

2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。

（前两周重点学习）3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安防在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。

干细胞培养方案如下：
1. 原代培养方案：
培养基成分：DMEM/F12（1:1）+10% FBS+1% L-Glutamine+1% penicillin/streptomycin；
步骤：
(1) 将骨髓、脐带血或胚胎等组织来源的细胞进行酶解，获得单个细胞；
(2) 分装到预处理好的培养皿中，并加入适量培养基，充分混匀；
(3) 放入37℃恒温培养箱中，每两天换一次新鲜的培养基；
(4) 观察细胞生长情况并进行定期检测以确保其品质。

2. 传代培养方案：
培养基成分同上；
步骤：
(1) 将原代培养的细胞进行足够程度的增殖，达到80%-90%的密度；
(2) 用胰酶等酶消化细胞，并分装到新的培养皿中；
(3) 加入适量的培养基，放入恒温培养箱中，每两天换一次新的培养基。

3. 无血清培养方案：
培养基成分：StemPro® MSC SFM XenoFree培养基或StemPro® NSC SFM XenoFree培养基等无血清培养基；
步骤：
(1) 将干细胞进行酶解，获得单个细胞；
(2) 分装到预处理好的培养皿中，加入适量的无血清培养基；
(3) 放入恒温培养箱中，每两天换一次新的培养基。

以上是常用的干细胞培养方案。

原代细胞培养的步骤嘿，咱今儿就来说说原代细胞培养那些事儿哈！你知道不，原代细胞培养就像是在打造一个小小的细胞家园。

首先呢，得准备好“家”的基础，也就是合适的培养器具，这可不能马虎呀，就好比建房子得有好的砖头水泥一样。

然后就是获取细胞啦，这就像是找一群可爱的小居民入住。

这可得小心着点，得用合适的方法把细胞从它们原本的环境中温柔地请出来，可不能太粗鲁啦，不然小细胞们会不高兴的哟！接下来就是把这些小居民们安置好，给它们提供舒适的环境，像合适的培养液啦、温度啦、湿度啦等等，这就像是给家里布置得舒舒服服的。

细胞住进去后，咱还得时刻关注着它们呢。

看看它们是不是开心地生长着呀，有没有啥问题呀。

这就像咱关心家里人一样，得时刻留意着。

在培养的过程中，可别小看了那些细节哦。

就好像家里的卫生一样，得保持干净整洁，不能有细菌病毒啥的来捣乱，不然小细胞们可就遭罪啦。

而且呀，这培养细胞还真得有点耐心呢。

不能着急，得慢慢地等它们长大、繁殖。

就像看着小孩子一点点长大一样，得有足够的耐心和爱心。

有时候可能会遇到一些小麻烦，比如细胞长得不咋好啦，或者出现了一些奇怪的现象啦。

这时候可不能慌，得冷静下来找找原因，想想办法解决。

哎呀，你说这原代细胞培养是不是挺有意思的呀？就像是在照顾一群小小的生命，看着它们在自己的努力下茁壮成长，那种成就感可不是一般的大呀！总之呢，原代细胞培养可不是一件简单的事儿，但只要咱用心去做，就一定能做好。

咱得像爱护宝贝一样爱护那些小细胞，给它们提供最好的条件，让它们能好好地生长、发挥它们的作用。

你说是不是这个理儿呀？。

成人脂肪间质干细胞的复苏和培养脂肪间充质干细胞是一种能分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的多能干细胞。

因其具有强大的增殖能力和免疫调节功能，故被广泛应用于组织工程，细胞治疗和基因治疗。

成人脂肪间质干细胞取自健康成人(18至45岁)抽脂手术所得脂肪组织，拥有强大的自我更新能力并具有多向分化潜能。

取自健康成人(18至45岁)抽脂手术所得脂肪组织，用成人脂肪间质干细胞完全培养基贴壁培养，传代扩增至第二代冻存，每支含细胞1×106个。

成人脂肪间质干细胞的复苏和培养1. 准备好37℃水浴。

2. 准备好成人脂肪间质干细胞完全培养基，温育到37℃。

3. 在15 mL离心管中加入9 mL完全培养基。

4. 从液氮中取出冻存的脂肪间质干细胞，立即放入-80℃冰箱（目的是让进入冻存管的液氮稍加挥发）。

5. 在-80℃放置2-3 min后，取出冻存细胞，将冻存管迅速放入37℃温水中，快速晃动使管中内含物尽快融化。

仔细观察，待冻存管内含物完全融化后取出。

注意：•尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险。

•要快速完成细胞复苏过程，融化过程时间过长，会造成复苏后的细胞活性较差。

6. 用70%-75%的酒精消毒冻存管口的外壁。

7. 在超净台中打开冻存管，用吸管将细胞冻存悬液移入装有完全培养基的离心管中。

注意尽量避免产生气泡。

8. 为了减少细胞损失，往冻存管中加入1 mL完全培养基，稍微吹打，用吸管将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。

9. 将细胞悬液经250 g（对应于Eppendorf 5810R离心机是1134 rpm）离心5 min。

10. 尽量去除上清液，向细胞沉淀物加入1-2 mL的完全培养基（已预热到37℃），轻轻吹打均匀。

11. 将细胞全部接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养器皿中，加入足量的完全培养基。

轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布。

12. 放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

细胞原代培养方法1. 胰酶消化法(1) 器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏，置平皿中。

(2) 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

130(3) 用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2)，再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

(4) 视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

(5) 加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

(6) 静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

(7) 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

(8) 加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

(9) 加入培养液l—2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

(10) 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。

细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同(如胶原酶，透明质酶等)。

2. 组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。

翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中(勿使组织漂起)，37℃继续培养。

3. 贴壁细胞传代方法(1) 吸光培养瓶中的培养液。

(2) 加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置2-10min(显微镜下动态监测) 。

(3) 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。

(4) 吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

(5) 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

(6) 加适量新鲜培养液于新培养瓶内。

脂肪干细胞脂肪干细胞第一节脂肪干细胞的生物特性2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分理处一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞（BMSC）形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。

此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASCE。

近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞。

因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不衰老等特点，目前脂肪干细胞已经成为脂肪组织工程中组织细胞的研究热点。

1. 脂肪干细胞的分离、培养脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。

常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。

原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。

平均每300mL脂肪组织可获得2×10~6×10个这样的细胞。

体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、aMEN、RPMI1640是ASC 的常用培养基。

一般只添加体积分数为10%的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。

在传代培养中，平均倍增时间为60h。

并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5%细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15%，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。

2.脂肪干细胞的鉴定Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。

但部分学者采用流式细胞仪和间接免疫荧光等方法，分别以因子Ⅷ、平滑肌蛋白、ASC的特异单克隆抗体鉴定ASC中是否存在内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞，结果发现前两种单克隆抗体抗阳性染色的细胞比例较少，绝大多数ASC单克隆抗体阳性染色的细胞，提示ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。

人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。

原代培养流程
原代培养分为4个步骤:1、获得样品2、分离组织3、解离分割组织块或获得细胞悬液4、将组织块或细胞悬液接种于培养器皿中
取材的用具:大小解剖剪、大小镊子、手术刀（用前消毒）、装有无血清培养基或PBS液的小瓶、小烧杯（10ml、50ml）、培养皿、培养瓶
所需溶液：乙醇、无血清培养基即LB-15、PBS平衡液配方可见书本51页、10倍胰酶液、EDTA溶液配制见书本55页、Nacl、双抗即青链霉素、胎牛血清注：一般配制培养液的用水应在配液前蒸馏最起码三蒸水或去离子水，不宜使用存放数日的三蒸水，以免影响培养用水的质量。

消化培养法操作流程：
选取花鲈幼鱼，在无菌室解剖，取出花鲈肝脏和肌肉组织器官后，用PBS清洗3遍，乙醇浸泡3-4分钟，再用PBS清洗3遍，出去血块，用无血清培养基清洗1遍，用10倍胰酶（胰蛋白酶0.5%、EDTA0.2%、Nacl0.8%）消化10-20分钟，去除红细胞、脂肪粒及外被摸，待组织块软化后用PBS清洗3次，后用剪刀将组织器官切成小块约1mm3，用完全培养基（空白培养基+1%双抗（Hyclone)+10%~20%胎牛血清）接种到培养瓶中培养。

在初始培养中，5-7d换一次培养基。

因故不能即时培养，可以将组织浸泡于培养液内，放置4度冰箱内。

如果组织很大先将其切成1cm2以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。

在修剪过程中，为避免组织干燥，可将其浸泡于少量培养液中。

组织块培养法操作步骤;。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。

组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。

2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。

酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。

3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。

常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。

4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。

传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。

可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。

2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。

3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。

选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。

4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。

在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。

注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。

2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。

3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。

必须确保这些条件处于合适的范围内。

4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。

过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。

5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。

6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。

细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。

遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。

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脂肪细胞培养人脂肪细胞（adipocyte）是十分好的讨论对象。

它们是正常细胞，常用来自大网膜脂肪组织或皮下结缔组织培养。

在特别培养条件下，它们不增殖，能分化成类似成熟的脂肪细胞。

在无血清培养液中，前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞，能生长增殖、汇集，并可传代。

常用前脂肪细胞（preadipocyte）原代培养法来讨论脂肪细胞的发育。

【材料】 1．组织来源腹股沟区皮下或腹膜后的脂肪组织。

2．培养用试剂 (1）清洗液：HBSS，不含Ca2+, Mg2+和，加入100U/ml和100ug/ml。

(2）消化液：Trypson/EDTA,0.05％，0.53 mmol EDTA ; Ⅱ型胶原酶，配成1 mg/ml HBSS液。

(3)溶解红细胞缓冲液10mmol KHC03,0.1 mmol EDTA,0.154mol NH4Cl，溶于去离子蒸馏水中。

(4）分化液 1）分化液（EDTA/F12+)：DMEM/F12添加15mmol HEPES,15mmol NaHC03,33umol、0.5 umol17 umol 泛酸（pantothenic acid),0.2nmol（triiodo-thyronine) ,0.1umol （dexamethasone) ,50U/ml、50ug/ml。

2）地塞米松：制备5 mmol 的EtOH干液，储存于-20℃中，稀释成10-5 mol的DMEM/F12的稀释液，用法时加入至1.Oml/l00ml的DMEM/Fl2。

3)三碘甲状腺原氨酸：制备蒸馏水配0.2mmol干液（106x终浓度）保存于-20℃，用DMEM/F12稀释成1/1000，然后加入100u1/100ml DMEM/F12。

4）泛酸：制备1000x终于浓度（17 mmol )蒸馏水配的用法液，分装成每0.5m1等分，保存于-20℃，用法时加入至1.Oml/l00m1的DMEM/F12, 5)DMEM/Fl2;1:1; DMEM的混合物和Ham补有F12养分混合物，含15 mmol NaHC03,15mmol HEPES,50U/ml和50ug/ml。