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中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。
干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。
在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。
在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。
干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。
二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。
2. 定向诱导干细胞分化。
3. 成长曲线测定。
4. 诱导分化后细胞鉴定。
5. 结果统计分析。
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红;张阳春;张常然;杨兴【摘要】背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。
<br> 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。
<br> 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。
选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。
选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。
<br> 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。
②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。
③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。
④DAPI是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI不损伤细胞活性，对细胞标记率高。
%BACKGROUND:Adipose-derived stem cels are a kind of mesenchyam stem cels with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cels in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cels from human subcutaneous adipose tissues folowed byin vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. <br> METHODS: Adipose-derived stem cels were isolated from human subcutaneous adipose tissue andcultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cel morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cels at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cel counting kit-8 method, and then cel growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cels underwentosteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. <br> RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cels can be successfuly isolated from human adipose tissues.(2) The growth process of human adipose-derived stem cels includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cels. Moreover, the population doubling time is shorter. (3). Human adipose-derived stem cels are positive for stem cel-related antigens, with low immunogenicity and the multi-differentiation potential. (4) Labeling human adipose-derived stem cels with DAPI is a simple efficient labeled method, and the labeling rate is high but the cytotoxicity is low【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)032【总页数】7页(P5155-5161)【关键词】干细胞;脂肪干细胞;人来源的脂肪干细胞;细胞分化;脂肪组织;细胞培养;细胞鉴定;国家自然科学基金【作者】肖建红;张阳春;张常然;杨兴【作者单位】中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院普通内科，广东省广州市 510700;中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
GW9662对正常人和甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响作者：雷翔许雪亮来源：《维吾尔医药》2013年第05期摘要：目的：研究GW9662对正常人和甲状腺相关眼病（Thyroid-associated Ophthalmolpathy， TAO）患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响。
方法：培养正常人和TAO 患者眼眶前脂肪细胞，在其增殖和分化的过程中加入GW9662。
MTT法观察GW9662对前脂肪细胞增殖的影响，油红O染色定量的方法观察GW9662对前脂肪细胞分化的影响。
结果：各浓度实验组的GW9662对眼眶前脂肪细胞的增殖影响较小，各组数据间差异无统计学意义。
在各个实验时间段， GW9662对眼眶前脂肪细胞有抑制分化的作用，在48h时作用最明显。
与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更明显。
结论：GW9662可抑制正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞的分化，并可能缓解因眼眶前脂肪细胞过度分化导致的TAO临床症状。
关键词：GW9662；眼眶；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化眼眶内脂肪组织的增生是引起TAO眶内容体积增加的重要因素，该过程的发生与眼眶内成熟脂肪细胞的前体细胞——前脂肪细胞的分化增强有关。
其中，TAO患者眼眶前脂肪细胞及其分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）表达的增强在该过程中起重要作用。
GW9662是PPARs的拮抗剂，可以竞争性结合PPARs配体结合域，从而阻断PPARs 配体的作用途径。
已有动物模型及实验研究证明GW9662可抑制脂肪细胞的分化[1，2]。
本实验研究GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响，以期为临床研究提供实验依据。
1 材料和方法1.1眼眶脂肪组织取自行眼球摘除术的患者眼眶，共4例4眼，年龄38～45（平均42）岁。
TAO眼眶脂肪组织取自眼眶减压术中，病情分级均为6级，共4例4只眼，年龄37～48（平均44）岁。
无血清原代培养人前脂肪细胞并诱导分化1朱惠娟，史轶蘩，邓洁英，龚凤英中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院内分泌科（100730）E-mail：huijuanzhu@摘 要：采用胶原酶消化法从人皮下脂肪中分离并原代培养人前脂肪细胞，通过对细胞形态学的观察、油红O对细胞内脂质染色，以及脂肪细胞标志性酶G-3-PDH活性的测定对细胞进行鉴定。
摸索在无血清条件下培养并诱导人前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的条件。
在无血清的基础培养基中前脂肪细胞可以维持增殖，增殖期的第3-10天为对数增长期。
无血清分化培养基培养4天后细胞形态逐渐变圆，并出现球性脂滴，脂滴的数量逐渐增多至分化培养的第21天到达顶峰。
在无血清培养的状态下成功诱导前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，为研究激素或细胞因子对前脂肪细胞的增殖或分化机制的研究打下了的基础。
关键词：无血清培养，原代培养，前脂肪细胞，增殖，分化1．引言随着全球经济的迅猛发展和物质的高度丰富，肥胖症正在以惊人的速度取代感染性和营养不良性疾病威胁人类的健康。
导致机体肥胖的脂肪组织是由脂肪细胞、前脂肪细胞、微血管内皮细胞和细胞外的基质成分组成的（1），过多热量以甘油三脂的形式存储在脂肪细胞内，脂肪细胞是在不同的转录因子诱导一系列特异基因表达下由前脂肪细胞分化而来的，而前脂肪细胞起源于胚胎中胚层的多能干细胞（2-4）。
目前认为在胚胎期就存在分化的脂肪细胞，在胚胎发育的后期和出生后的儿童期脂肪细胞迅速分化，到了成人期，虽然主要以脂肪细胞的体积增加为主，但前脂肪细胞仍然保留了分化能力，在适当的生理条件诱导下能够不断地分化成为脂肪细胞。
目前对前脂肪细胞的研究主要是通过体外细胞培养的方法进行的。
目前体外用于前脂肪细胞和脂肪细胞研究的细胞系主要有三类：1）来自胚胎的全潜能（totipotent）胚胎干细胞,能生成各种细胞系（ES细胞）(5)。
12）以C3H10T1/2、NIH3T3为代表的多潜能（multipotent）干细胞系；3）以3T3-L1、3T3-F442和Ob17为主的前脂肪细胞系是目前应用最广泛的前脂肪细胞分化为脂肪细胞研究的细胞系。
此外2001年， Wabitsch M和他的同事报道了用一例Simpson- Golabi-Behmel syndrome (SGBS)的患者脂肪组织分离出前脂肪细胞首次建立的人前脂肪细胞系（6）。
但是非整倍体的前脂肪细胞系在诱导成为永生细胞的过程中细胞的分化能力会受到影响，甚至丧失了其体内的固有生理环境，尤其是前脂肪细胞系不能反映不同年龄、不同部位的脂肪细胞的生物学特点。
而原代培养的细胞刚刚离体，1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助（20020023051）- 1 -生物学特征没有发生很大的变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内细胞生长特性，适合细胞分化的实验研究。
无论是前脂肪细胞系还是原代培养的前脂肪细胞在胰岛素、糖皮质激素等激素的诱导下均可分化成为脂肪细胞。
目前通过在前脂肪细胞增殖和分化的过程中加入或对抗某些细胞因子或激素以研究这些细胞因子或激素在前脂肪细胞增殖和分化中的作用机制仍是主要的实验研究方法，但是血清中含有多种细胞因子和激素类物质，会干扰对细胞因子和激素调控作用的研究，因此无血清培养是研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化作用的重要条件。
国内迄今为止未见到在无血清的条件下维持前脂肪细胞增殖和诱导分化的研究报道。
我们在本实验室建立了人前脂肪细胞的原代培养方法，通过观察细胞形态的变化，油红O染色和测定细胞内G-3-PDH酶活性的方法对细胞进行了生物学的鉴定。
探索了在无血清的状态下维持人前脂肪细胞的增殖和分化的方法。
为进一步研究激素或细胞因子对前脂肪细胞增殖和分化提供了有力的实验手段。
2．材料和方法：2．1主要试剂和仪器CO2培养箱（Heraeus ，德国），超净工作台（北京半导体设备一厂）台式离心机（北京医用离心机厂），恒温水浴槽 （北京半导体设备一厂），恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂），倒置相差显微镜及摄像系统（ Olympus，日本），全自动酶标仪（Anthos，澳大利亚），超声破碎仪（AHSECO公司）。
DMEM/F12培养基（Hyclone公司，美国），胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所），Ⅰ型胶原酶（Gibco-BRL公司，美国），胰蛋白酶（GiBco-BRL公司，美国），噻唑兰、胰岛素、甲状腺素、地塞米松、IMBX、泛酸、转铁蛋白（Sigma公司，美国），生物素（上海生物制品厂），油红O（Ameresco公司，美国）。
原代培养基础培养基的配制：DMEM培养基添加10%灭活后的胎牛血清、青霉素100IU/ml，链霉素100µg/ml、生物素(33µM)、泛酸(17µM)、转铁蛋白(10µg/ml)（括号内为添加试剂的终浓度）。
无血清原代培养分化培养基的配制：在DMEM/F12无血清培养基中添加胰岛素（0.5µM）、地塞米松(0.25µM)、甲状腺素(0.2nM)、IMBX(0.5nM)。
2．2试验方法：2．2．1原代培养人前脂肪细胞的分离培养：取无菌条件下新鲜切除的人腹部皮下脂肪组织约5-10g，放入培养皿。
用1X PBS冲洗后尽量剔除结缔组织和可见的血管。
充分剪碎脂肪组织加入含5毫升胶原酶的离心管，37℃水浴震荡消化40分钟。
将含有组织的消化液通过孔径25µm（200目）的筛网过滤，分别收集滤液和未过滤的组织块。
将滤液以600g离心5分钟弃上清，加入原代培养的基础培养- 2 -基制成细胞悬液。
将未滤过的组织按上述的过程再消化处理一次，将两次获得的细胞悬液混匀计数，并按104个/cm2的密度接种在培养瓶中，于37℃，5%CO2培养箱中培养。
接种12-16小时后细胞基本全部贴壁，可以使用1XPBS冲洗细胞2-3次后换为无血清培养基继续培养。
4-6天后细胞铺满培养瓶的70%以上就可以换为分化培养基诱导细胞分化。
在增殖状态下的前脂肪细胞可以使用胰蛋白酶消化的方法进行传代，并可以冻存和复苏。
2．2．2前脂肪细胞形态学观察：使用倒置相差显微镜直接观察到细胞形态的变化以及分化过程中细胞内逐渐增多的脂肪滴。
油红O可以特异性的使脂质着色，，前脂肪细胞在分化培养基中逐渐分化成为成熟的脂肪细胞，细胞质内有脂质滴聚集因此油红O染色可以用于脂肪细胞的鉴定，并进行分化状态的观察和分化程度的间接定量分析。
2．2．3前脂肪细胞生物学测定：用MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）法观察人前脂肪细胞生长状态：前脂肪细胞在96孔培养板分别生长至2，4，6，8，10及12天时用MTT法检测细胞的生长状态。
酶标仪492nm波长处测OD值，无细胞的孔做空白对照。
前脂肪细胞分化为脂肪细胞，具有一些特征性的标志，其中催化甘油三脂合成的甘油-3-磷酸脱氢酶（G-3-PDH）是脂肪细胞特异性表达的一种酶类。
从诱导分化第2天前脂肪细胞内的G-3-PDH活性从分化前无活性显著增加，并随着分化而逐渐增加，至分化末期达到峰值。
超声破碎的方法处理脂肪细胞后将磷酸二羟丙酮作为反应底物，测定单位重量的G-3-PDH蛋白的酶活性。
3．结果3.1原代人前脂肪细胞的增殖过程：3．1．1形态学观察：新消化分离的人前脂肪细胞接种12小时后可以基本完全贴壁，细胞呈梭形、多角形或扇形；细胞核呈卵圆形，位于细胞质的中央，显微镜下观察形态类似成纤维细胞，细胞在第3天开始增殖，聚集性生长，细胞排列成螺旋形、放射状；细胞在培养的4-10天增殖迅速，当细胞逐渐融合后生长速度开始逐渐减慢。
在增殖过程中的前脂肪细胞使用油红O染色完全不能着色。
原代人前脂肪细胞增殖第8天（光镜，×200）- 3 -3．1．2 MTT法对3例不同体重指数患者的前脂肪细胞的无血清培养基中的增殖状况进 行了观察。
患者情况如下：标本序号 年龄 性别 BMI（Kg/m2） 患病情况1 23 F 22.1 阑尾炎2 36 M 26.5 胆结石3 58 F 31.1 结肠良性占位人前脂肪细胞在无血清的培养基中增殖状况：接种后12-16小时细胞基本贴壁，1XPBS 冲洗后立即换为无血清培养基，接种后的第4天开始进入对数增长期，细胞数显著增加到接种后的第10天进入增殖的平台期。
细胞数目的倍增时间为60-72小时。
图：原代人前脂肪细胞无血清基础培养基中生长曲线(n=8，N=3)3.2原代培养的人前脂肪细胞分化过程：3.2.1人前脂肪细胞分化过程的形态学观察：新消化分离的人前脂肪细胞接种后的4-10天增殖迅速，当细胞逐渐融合后生长速度开始逐渐减慢。
换成分化培养基诱导前脂肪细胞分化第2天开始镜下观察细胞体积变大，细胞质变浅考虑是细胞贴壁更加紧密，围绕细胞核出现细胞器呈环状聚集（necklace），在分化的第4天开始细胞内可以观察到反光的脂质小滴，并随着分化的进展越来越多的细胞出现脂质小滴，而且单个细胞内的脂质小滴的数目逐渐增加，并使细胞的形状由多角形逐渐变为椭圆形或圆形，到了分化的12-14天一些分化的脂肪细胞内的脂肪小滴会相互融合为较大的脂肪滴，并将细胞核推向细胞的一侧。
到分化的21天，约有92%（88%——94%）的细胞可以- 4 -- 5 -分化为成熟的脂肪细胞。
原代人前脂肪细胞分化第14天（光镜，×200）3.2.2油红O 染色的方法观察前脂肪细胞分化过程：随着前脂肪细胞的分化，细胞内能被油红O 着红色，而洗脱后未分化的细胞和细胞内非脂质聚集的部分未着色的脂质逐渐增多增多，间接反应脂肪细胞逐渐分化成熟。
分化第8天（油红O 染色，×200）3.2.3分化的人前脂肪细胞内G-3-PDH 酶活性测定：在未分化的前脂肪细胞内未测到G-3-PDH 的活性。
从诱导分化的第2天可以测到前脂肪细胞内G-3-PDH 的活性，并逐渐增高，从分化的第4到16天为线形增加，到分化的第16天G-3-PDH 的活性到达峰值，并维持到分化的末期21天。
人原代前脂肪细胞分化过程G-3-PDH活性曲线(N=3,n=3)4.讨论：在本实验室建立了人前脂肪细胞原代培养的方法，诱导前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞，并实现了在无血清培养的条件下维持前脂肪细胞的增殖和分化，为研究各种细胞因子或激素对前脂肪细胞的增殖或分化的作用提供了实验细胞模型。
国际上对脂肪细胞的形态及功能的研究可以追溯到1950s年代，Trowell等将大鼠的脂肪组织碎片进行培养和观察（7）。
此后随着对脂肪组织研究的深入，发现脂肪细胞是由形态类似成纤维细胞的脂肪细胞前体细胞（adipocyte precursor cell ）在适当的条件诱导下分化而来的，直到1971年W.J.Poznanski 等首次发现用胶原酶消化并离心的方法可以将漂浮在上层的脂肪细胞和沉淀在下层的基质血管细胞（stromal-vescular cell，SV细胞）分离开来，而后者在有血清的培养基中可以分化成为成熟的脂肪细胞，被命名为脂肪前体细胞或前脂肪细胞（8、9）。
