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一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后A C Ss的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除AS Cs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DM EM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsi n,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（C D29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
2.2.1.脂肪酸的变化分析试剂：0.3％甲醛、6 mol/l HCl-CH3OH溶液、三氯甲烷方法：GC—MS联用分析测定，步骤如下：（1）菌体的培养与收集Ⅰ组实验菌株用YPD液体培养基培养，在培养基中添加一定量的抗冻保护剂，接种后放入30℃、150 r／min的摇床中培养24 h。
细胞振荡培养至生长对数中期，移取适量细胞悬浮液至-30℃冰箱冷冻7d，取出30℃下解冻5-10min，用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。
空白样用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻24h，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。
Ⅱ组实验菌株用于面包冷冻面团的制备，添加抗冻保护剂，于-20℃冷冻30d 后取出解冻，取20g解冻后的面团，分散于180ml无菌水中，震荡30min，静置15min，离心并取上清液。
用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心15 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。
空白样则不添加抗冻保护剂，其余处理方法一样。
（2）脂肪酸的甲基化与提取取50 mg冻干细胞加入6 mol/l HCl-CH3OH溶液2 ml，置100℃的条件下盐酸水解甲基化3 h，溶液呈现棕褐色(或黑褐色)，取出，置室温下冷却。
加入正己烷1.5ml振荡。
经4000 r／min离心10min，收集上清液再加入正己烷1.5ml 抽提一次，合并两次上清液，加入蒸馏水3ml，经4000 r／min离心10 min，收吹干，加入10μl三氯甲烷制备脂肪酸酯化液。
集上清液于离心管中。
用流动N2（3）薄层层析用玻璃毛细管取脂肪酸酯化液点在硅胶G-TLC薄层板上，以正己烷+无水乙醚(1+1)为展层系统，待层析液至硅胶板上缘后立即取出薄层板，风干。
1、斐林试剂配制：1）甲液质量浓度为0.1g/ml，取10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml2）乙液质量浓度为0.05g/ml，取5gCuSO4溶于蒸馏水，稀释至100ml临用时将甲、乙液等量混合作用：鉴定还原性糖：C6H12O6、果糖、麦芽糖、乳糖等。
还原性糖与斐林试剂发生作用，生成砖红色沉淀。
如用于鉴定组织液中有否还原性糖、糖尿病人尿成分分析、酶专一性探索等。
2、班氏尿糖定性试剂配制：称取17.4克无水硫酸铜（CuSO4）溶解于100毫升热蒸馏水中，冷却后，稀释到150毫升。
称取柠檬酸钠173克及无水碳酸钠（Na2CO3）100克，加蒸馏水600毫升，加热使之溶解，冷却后，稀释到850毫升。
把硫酸铜溶液倾入柠檬酸钠及碳酸钠溶液中，搅匀后即为班氏尿糖定性试剂。
用细口瓶贮存备用（为了防止氢氧化铜沉淀的生成，故加入柠檬酸钠。
柠檬酸钠是一种亲水性掩蔽性络合物形成剂，它能与铜离子形成可溶性络盐）。
使用方法同斐林试剂，所不同的是班氏试剂可长期使用。
3、双缩脲试剂配制：A液：质量浓度为0.1g/ml，取10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mlB液：质量浓度为0.01g/ml，取1gCuSO4溶于蒸馏水，稀释至100ml使用时，先加A液，后加B液作用：鉴定蛋白质，蛋白质与双缩脲试剂发生作用，可产生紫色反应。
也可用于鉴定多肽。
4、苏丹Ⅲ配制：取0.1g苏丹Ⅲ，溶解在20ml95%酒精中作用：鉴定脂肪，脂肪可以被苏丹Ⅲ染成橘黄色（或被苏丹Ⅳ染成红色）。
5、质量分数为15%的盐酸和体积分数为95%的酒精溶液的混合液（1：1）。
作用：用于洋葱根尖的解离，即使组织中的细胞相互分离开来。
能杀死细胞固定。
6、质量浓度为0.01g/mL的或0.02g/mL龙胆紫溶液（或醋酸洋红溶液）配制：是将龙胆紫溶解在质量分阶段数为2%的醋酸溶液中配制而成作用：使细胞核内的染色体着色，便于观察。
7、质量浓度为0.3g/ml的蔗糖溶液作用：观察成熟植物细胞质分离时用。
生物学中常用的试剂：1.斐林试剂：成分： ml NaOH( 甲液 )和 ml CuSO4( 乙液 )。
用法：将斐林试剂甲液和乙液混淆，再将混淆后的斐林试剂倒入待测液，水浴加热，如待测液中存在复原糖，则呈砖红色。
2.班氏糖定性试剂：为蓝色溶液。
和葡萄糖混淆后开水浴会出现砖红色积淀。
用于尿糖的测定。
3.双缩脲试剂：成分：ml NaOH(甲液 )和ml CuSO4(乙液 )。
用法：向待测液中先加入2ml甲液，摇匀，再向此中加入3~4 滴乙液，摇匀。
如待测中存在蛋白质，则体现紫色。
4.苏丹Ⅲ：用法：取苏丹Ⅲ颗粒溶于 95%的酒精中，摇匀。
用于检测脂肪。
可将脂肪染成橘黄色 (被苏丹Ⅳ染成红色 )。
5.二苯胺：用于判定DNA 。
DNA遇二苯胺(开水浴 )会被染成蓝色。
6.甲基绿：用于判定DNA 。
DNA遇甲基绿(常温 )会被染成蓝绿色。
吡罗红：检测RNA ，呈红色7、 50%的酒精溶液：用于洗去苏丹Ⅲ在脂肪上的浮色。
8、 70%的酒精溶液：用于医学临床上的消毒灭菌。
9、95%的酒精溶液： DNA 不溶于酒精，特别是体积分数为95%的冷冻酒精，而细胞中的某些物质能够溶解于酒精无水乙醇：提取色素10、 15%的盐酸：和95%的酒精溶液等体积混淆可用于解离根尖，使细胞分别开来。
“有丝分裂察看”和“低温引诱染色体加倍”中15％盐酸能够使洋葱细胞的细胞壁融化,并使细胞间的中胶层物质溶解,进而达到分别细胞的目的。
洗去卡诺氏液8％盐酸：（ 1）盐酸能改变细胞膜的通透性,加快染色剂的跨膜运输；（ 2）盐酸使染色体中的 DNA与蛋白质分离,便于 DNA 与染色剂的联合11.龙胆紫溶液或醋酸洋红：碱性染料，用于染色体染色时，前者呈深蓝色，后者呈红色改良苯酚品红染液：检测染色体，红色健那绿：检测线粒体，专一性让线粒体染色呈蓝绿色%的肝脏、 3%的过氧化氢、 %的氯化铁：用于比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率。
（新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶）13、3%的可溶性淀粉溶液、3%的蔗糖溶液、 2%的新鲜淀粉酶溶液：用于探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用实验。
1.0 L(SH30021.01B, Hyclone) 2. 胎牛血清( Fetal Bovine Serum ，FBS)10%1%1 pmo/ L10 mol / L黄嘌呤0.5 mmol/L200 mol / L (ES-009-B, Millipore)(TMS-AB2C, CHEMICON ) 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)分子量：5808(91077C—1g, Sigma)分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)分子量：357.79(I7378 —5G, Sigma)脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序、试剂准备一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM ）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1. 极限必须培养基(Dulbecco 'S Modified Eagle Medium，DMEM)二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称f=p 曰.质量浓缩倍数配制方法1. Stock A 分装1ml/管X100胎牛血清1ml/ 管1X( liquid )保存：-20C2. Stock B 分装0.1ml/管X100青霉素/ 链霉素0.1ml/ 管100X( liquid )保存：-20C3. Stock C 溶于30ml 无水乙醇（0.1%）地塞米松0.0117738 g 1000X 分装0.1ml/管X300保存：-20C4. Stock D 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L ，PH2.0)胰岛素0.05808 g 100X 分装0.1ml/管X100保存：4C5. Stock E 溶于 2.5ml DMSO(0. 5%)3-异丁基-1 -甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 分装0.05ml/EP 管X50保存：-20C6. Stock F 溶于2ml 无水乙醇（0.2%）吲哚美辛0.07155 g 500X分装0.02ml/ 管X100 保存：-20C （三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1. 取DMEM（L）8.72ml 加入15ml 离心管（BD ）2. 加1 管Stock A（1ml）；3. 加1 管Stock B（0.1ml）；4. 取1 管Stock C （0.1ml）溶解，加入0.01ml ;5. 加1 管Stock E（0.05ml）；6. 加1 管Stock F （0.02ml）;7. 加1 管Stock D （0.1ml）;8. 测渗透压，调pH7.2-7.4;9. 0.22 m微孔过滤，4C贮存，一周内使用。
软脂酸制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的方法陈思思;王彦;杨静;陈显久【摘要】目的用软脂酸(PA)诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨用PA制备3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)模型的方法.方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,用油红O染色法鉴定细胞.用不同浓度的PA(0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5mmol/L、1.0 mmol/L)干预3T3-L1脂肪细胞24 h,收集各组细胞培养液,用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖的含量,观察PA对3T3-L1脂肪细胞糖摄取的影响.结果 0.25 mmol/L PA就可明显抑制成熟的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取(P＜0.01),且呈浓度依赖性.与对照组相比,0.25 mmol/L PA组、0.5 mmol/L PA组、1.0 mmol/L PA组葡萄糖摄取率分别下降5.25％、10.29％、14.54％.结论在胰岛素刺激下,0.25 mmol/L PA作用于3T3-L1脂肪细胞24 h就可诱导细胞产生IR,且随着浓度的增加其效果逐渐增强.【期刊名称】《中西医结合心脑血管病杂志》【年(卷),期】2012(010)002【总页数】2页(P197-198)【关键词】3T3-L1脂肪细胞;胰岛素抵抗;软脂酸【作者】陈思思;王彦;杨静;陈显久【作者单位】山西省临汾市人民医院,041000;山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学;山西医科大学【正文语种】中文【中图分类】R587;R255.4胰岛素抵抗（IR）是胰岛素作用的靶器官对胰岛素作用的敏感性下降，即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种代谢状态。
胰岛素与细胞表面受体的结合或胰岛素信号在胞内的传递过程中，任何一个信号转导环节受到抑制均有可能引起IR［1］。
研究表明在肥胖者体内血浆游离脂肪酸（FFA）的水平是增高的［2］，血浆高水平的FFA显著影响外周组织细胞，特别是脂肪细胞对胰岛素的敏感性，使脂肪细胞糖代谢功能障碍，导致IR［3］。
生物实验中涉及的染色剂1 斐林试剂检测可溶性还原糖原理：还原糖+斐林试剂→砖红色沉淀注意：斐林试剂的甲液和乙液要等量混合均匀后方可使用,而且是现用现配,条件需要水浴加热.应用：检验和检测某糖是否为还原糖；不同生物组织中含糖量高低的测定；在医学上进行疾病的诊断,如糖尿病、肾炎.2 苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ检测脂肪原理：苏丹Ⅲ+脂肪→橘黄色；苏丹Ⅳ+脂肪→红色注意：脂肪的鉴定需要用显微镜观察.应用：检测食品中营养成分是否含有脂肪.3 双缩脲试剂检测蛋白质原理：蛋白质+双缩脲试剂→紫色注意：双缩脲试剂在使用时,先加A液再加B液,反应条件为常温（不需要加热）.应用：鉴定某些消化液中含有蛋白质；用于劣质奶粉的鉴定.4 碘液检测淀粉原理：淀粉+碘液→蓝色注意：这里的碘是单质碘,而不是离子碘.应用：检测食品中营养成分是否含有淀粉5 DNA的染色与鉴定染色原理：DNA+甲基绿→绿色应用：可以显示DNA在细胞中的分布.鉴定原理：DNA+二苯胺→蓝色应用：用于DNA粗提取实验的鉴定试剂.6 吡罗红使RNA呈现红色原理：RNA+吡罗红→红色应用：可以显示RNA在细胞中的分布.注意：在观察DNA和RNA在细胞中的分布时用的是甲基绿和吡罗红混合染色剂,而不是单独染色.7 台盼蓝使死细胞染成蓝色原理：正常的活细胞,细胞膜结构完整具有选择透过性能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内；死细胞或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色.应用：区分活细胞和死细胞；检测细胞膜的完整性.8 线粒体的染色原理：健那绿染液是专一性染线粒体的活细胞染料,可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.应用：可以用高倍镜观察细胞中线粒体的存在.9 酒精的检测原理：橙色的重铬酸钾溶液在酸性条件下与酒精发生化学反应,变成灰绿色.应用：探究酵母菌细胞呼吸的方式；制作果酒时检验是否产生了酒精；检查司机是否酒后驾驶.10 CO2的检测原理：CO2可以使澄清的石灰水变混浊,也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿在变黄.应用：根据石灰水混浊程度或溴麝香草酚蓝水溶液变黄的时间长短,可以检测酵母菌培养液中CO2的产生情况.11 染色体（或染色质）的染色原理：染色体容易被碱性染料（如龙胆紫溶液或醋酸洋红溶液）染成深色.应用：用高倍镜观察细胞的有丝分裂.12 吲哚酚试剂与维生素C溶液呈褪色反应原理：吲哚酚即2,6-二氯酚靛酚钠,其水溶液为蓝紫色,维生素C具有还原性,能将其褪色.应用：可用于检测食品营养成分中是否含有维生素C.13 亚硝酸盐的检测出现玫瑰红原理：在盐酸酸化条件下,亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后,与N-1-萘基乙胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料.应用：将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较,可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量. 14 脲酶的检测原理：细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,使PH升高,从而使酚红指示剂变红. 应用：在以尿素为唯一氮源的培养基加入酚红指示剂,培养某种细菌后,看指示剂变红与否可以鉴定这种细菌能否分解尿素.15 伊红美蓝检测大肠杆菌原理：在伊红美蓝培养基上,大肠杆菌的代谢产物（有机酸）与伊红美蓝结合使菌落呈现黑色.应用：用滤膜法测定水中大肠杆菌的含量.16 刚果红检测纤维素分解菌原理：刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应.当在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物.当纤维素被纤维素分解菌分解后,刚果红-纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈.应用：筛选纤维素分解菌.。
Sigma(de)试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat16170-078/Lot 1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat 10437-028/Lot 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿, 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿.共6个10cm皿,将其中5个皿细胞冻存于-80°,将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿,待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80.二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化.两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d 开始加诱导剂,诱导方案严格按照之前计划(de)施行,诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d,后换诱导剂③培养,以后每48h换液,均采用诱导剂③,8天左右即可看到脂滴,此次整个诱导过程共用14天,出脂滴后继续48h换液,目(de)主要是获得更多(de)脂肪细胞.三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利,之前考虑到(de)诸如细胞可能贴壁不牢,易漂浮(de)情况基本未出现（漂浮很少）,诱导剂配置过程中由于剂量极低,担心(de)浓度不准问题,后证明对分化影响不是很大.一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制.分子量222,几乎不溶于水,现配现用,0.22um过滤除菌.100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH.每毫升培养基加10ul IBMX.2、胰岛素溶液配制.比较难溶,-20℃保存1个月,使用PH 2~3(de)稀盐酸溶液助溶,0.22um过滤除菌.100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL.每毫升培养基加10ul胰岛素.3、地塞米松溶液配制.分子量516.41,0.22um过滤除菌,-20℃保存1个月.使用无水乙醇溶解,1000×母液（1mmol/L）.1mg溶于25ml无水乙醇,每1ml加10ul.二、3T3-LI细胞系(de)培养、诱导1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中,37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养,2d换液一次.2、3T3-Ll细胞系(de)诱导：细胞生长状态良好时实验.细胞传代分瓶,每一瓶中(de)细胞数约为1×105,每48h换液.当细胞接触抑制2d后,加入诱导剂 (10%胎牛血清FBS(de)高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素,1umol/L地塞米松,0.5mmol/L IBMX）,培养2d.然后换为10%胎牛血清(de)高糖DMEM培养液（含10ug/ml(de)胰岛素）,培养2d.改为10%(de)胎牛血清(de)DMEM培养液,每2d换液一直到诱导成为成熟(de)脂肪细胞(细胞体积增大,细胞中出现串状(de)脂肪滴),占总体积(de)90%.三、注意事项1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂.太早,细胞没有退出生长周期.太迟,细胞诱导后容易漂浮.2、3T3细胞株20代以后分化困难,最好挑选5代左右开始诱导分化.将细胞冻存起来,使用时再复苏.3、大约需要8~10天,可以诱导分化成功.之后换液处理需要轻缓,以免损失细胞.4、诱导前后使用油红O染色鉴定.证明是成熟脂肪细胞,而不是空泡样变性.方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合(de)红色染料,与未分化细胞和细胞外脂质不结合.吸弃培养板里(de)分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%(de)甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔,室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液,室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次,洗去未着色染料；显微镜下观察,照相.。
脂肪细胞培养所需试剂
1、低糖-DMEM、高糖DMEM/F12 (1∶1)各2袋
2、胎牛血清10%1瓶
3、胰蛋白酶0.25%
4、0.1%胶原酶Ⅰ
5、1μmol.L-1地塞米松、50μmol.L-1吲哚美辛（200）、0.5 mmol 3-异丁基-1-甲基黄
嘌呤（IBMX）和胰岛素(Sigma, USA)链霉素、青霉素、10μmol.L-1胰岛素
6、25ml培养瓶20个
7、6孔培养板8个、24孔板4个
8、PBS、酒精、无菌棉球、油性记号笔、封口膜
10、油红O
11、4%多聚甲醛、苏木精
眼科剪、眼科镊各2把、200目筛网2个、150目筛网2个、CO2培养箱、25ml 离心管15支、吸管40支（长嘴）、5ml塑料带盖离心管10支、37℃水温摇床、培养皿5个、50ml烧杯4个
所需配制的试剂
1、PBS液：
2、DMEM普通培养基：
3、成脂诱导培养基
4、0.075%胶原酶
5、0.5%胰蛋白酶
方法
1、MA 提纯及去分化
手术切除的腹部脂肪5ml, 冷冻，在2h内将脂肪组织送至实验室。
PBS反复冲洗，在通用培养液剔除血管，剪碎。
PBS 反复冲洗，置于 0.075% Ⅰ型胶原酶 37℃恒温摇床消化 45 min，期间反复震荡混匀，等量体积的完全培养基（高糖 DMEM、10%FBS、1% 青、链霉素）中和后，200 μm 尼龙网过滤，滤过物以离心半径 4 cm、180r/min离心10min，收集第2层脂肪细胞用200μm和150μm尼龙网过滤，去除其他细胞污染。
采用 Tholpady 等 [11] 方法收集人成熟脂肪细胞（mature adipocytes，MA）接种于 25 cm2培养瓶，每瓶（0.5 ～ 1.0）×105个细胞，瓶内充满完全培养基，将培养瓶翻转倒置于 37℃、5%CO2 培养箱内，使漂浮的脂肪细胞接触培养瓶底；48 h 后翻正培养瓶，吸出漂浮的 MA 悬液，接种于新的 25 cm2 培养瓶，进行新一轮天花板贴壁培养；48 h 后重复上一过程，以清除成纤维细胞状贴壁细胞；重复该过程至倒置相差显微镜下观察无成纤维细胞状细胞污染为止。
吸出 MA悬液，接种于一倒置、密封、充满完全培养基的 25 cm2培养瓶内，放入孵箱培养 10 d 使 MA 贴壁牢固。
10 d后翻正培养瓶，每 2 天更换完全培养基，
每天倒置相差显微镜下观察贴壁MA的变化。
当MA完全脱去脂滴，呈长梭形，去分化为 DA，并且生长融合达 80% 时，即可传代。
原代 DA 行油红 O 染色鉴定。
2、成脂分化：取第 4 代黏附贴壁的 DA 和 ADSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为1×105个/培养皿接种于培养皿中。
在完全培养基下孵育24h，使细胞贴壁并伸展。
24h后更换脂肪诱导DMEM培养基（含10%FBS、1%青、链霉素、1μmol/L 地塞米松、10μmol/L胰岛素、200μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/LIBMX）。
以仅含10%FBS、1% 双抗的DMEM 完全培养基培养作为阴性对照。
每3天更换1次培养基。
3、油红O染色形态学观察：成脂诱导14天后，弃原培养液，PBS 漂洗后，4%多聚甲醛固定20 min,, PBS洗2次，0.5%油红O染色30min,, PBS洗1次,显微镜下观察细胞内脂质。
并于14d时计数任意10个培养皿内100倍视野下共500 个细胞中油红 O 染色阳性细胞数，计算细胞成脂分化率，公式为：油红 O 染色阳性细胞数 /500 × 100%
即无菌条件下,取猪脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,消化后的混和液过200目细胞筛;收集滤液,离心5 min (1 000r/min);收集上清液,加适量无血清培养基稀释洗涤,离心5 min (500 r/min);取500μl(4×105)上层离心液加入25 cm2培养瓶中(此培养瓶预先灌满含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基,在37℃、5%CO2培养箱中静止培养4~6 h,使培养瓶内保持均衡),移去瓶内所有气泡;盖紧瓶盖,颠倒放置培养瓶(凸面朝上)并使其保持水平,在37℃、5% CO2培养箱中培养.成熟脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到“天花板”面.。
