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3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。
100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。
保存温度我记不清了，你自己查一下。
Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。
最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。
一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。
未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。
许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。
提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。
利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南现代生物技术的发展为各个领域带来了许多突破性的技术和方法，其中包括利用培育技术进行脂肪细胞培养。
脂肪细胞是人体内一种特殊的细胞类型，其对于肥胖和代谢疾病等研究具有重要意义。
本文将详细介绍利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南，希望能为相关研究提供有价值的参考。
一、培养基准备脂肪细胞培养的第一步是准备适当的培养基。
建议使用基于DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）的培养基，并添加适当的补充物，如胰岛素、脂肪酸结合蛋白和抗生素。
同时，为了提供适宜的细胞黏附条件，可以将底物预先涂覆成聚-L-赖氨酸、明胶等。
二、细胞获取与传代脂肪细胞的获取可以通过组织切割、离心分离或细胞系购买等方式进行。
在获得脂肪组织后，应迅速将其转移到培养基中，并进行细胞分散。
这可以通过酶处理（使用胰蛋白酶）或机械分散等方法实现。
分散后的细胞应经过离心沉淀，并将上清转移至新的培养基中进行培养。
为了保持细胞的健康生长，定期进行细胞传代非常重要。
一般情况下，当培养皿中的细胞达到80%～90%的密度时，可进行传代。
传代时应用酶处理或机械振荡将细胞分散，然后按照适当的比例用新鲜培养基进行传代。
三、脂肪细胞分化脂肪细胞培养的核心目标是实现细胞的分化，使其发展成成熟的脂肪细胞。
为此，可在培养过程中添加适当的诱导剂，如甲基异丁基黄酮（IBMX）、地塞米松和青霉素/链霉素。
这些诱导剂可以启动脂肪细胞分化的关键信号途径，从而促进细胞向脂肪细胞的分化。
诱导过程中，要注意避免过度分化或细胞死亡。
适量的诱导剂添加和适时的培养基更换是维持细胞健康的关键。
此外，还可以通过观察细胞形态和特定的标记物表达来判断细胞分化的程度。
四、细胞存活与细胞功能评估脂肪细胞培养后，应对细胞存活和功能进行评估。
细胞存活率可以通过尝试剂（如Trypan blue染色）进行测定。
此外，还可以检测细胞中特定标记物的表达，如脂肪细胞特异性的标记物PPARγ和脂肪酸结合蛋白等。
3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。
Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。
加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。
诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。
使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。
诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。
Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。
Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。
这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。
Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。
细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。
固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。
Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。
取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。
Step8: 获得结果并进行后期处理。
Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexam ethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (becom e more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The m edia will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5 mmol/L IBMX（储存液浓度0.5 mmol/L）、终浓度为1 umol/L(储存液浓度为1 mg/ml (2.5 mmol/L)) DEX和终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48 h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）加入aspirin(5 mM)，salsalate(1、5 mM)3)48 h后换含终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天，3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
油红O染色1）先小心轻缓倒去培养夜。
2）用pbs轻缓漂洗。
3）加10%多聚甲醛固定30 min。
4）用60％异丙醇洗涤5）油红O母液现用现配：称取0.5g油红O粉末，以异丙醇溶解并定容至100 ml，4℃避光贮存。
稀释油红O母液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10 min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。
6）油红O染色10 min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1. 5 ml，24孔加0.5-1 ml（实际染色时间1小时都可以）。
7）脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。
8）甘油明胶封片。
9）显微镜观察拍照。
TL诱导分化成熟脂肪细胞方案为了诱导分化成熟脂肪细胞，需要采取一系列措施来模拟体内脂肪细胞的发育过程。
下面是一个基于胎儿稳定细胞株人类成熟脂肪细胞系（ST-13）的方案，在富含小鼠成年体内碎屑坏死和抗生素的DMEM培养基中进行诱导分化。
1.培养脂肪前体细胞：将ST-13细胞接种于DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的条件下培养。
培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和生长因子（如胰岛素、肾上腺皮质激素等），以促进细胞增殖和生长。
2. 诱导分化：当细胞生长到80%的密度时，将培养基更换为富含诱导因子的培养基，如胰岛素、胰高血糖素苷（IBMX）和去氧皮质酮（Dex）等。
让细胞在这样的培养基中继续培养48小时。
3.培养终分化脂肪细胞：将细胞培养基更换为富含10%FBS和高浓度胰岛素的DMEM培养基。
这样的培养条件可以帮助细胞继续分化成完全成熟的脂肪细胞。
4. 油红O染色：使用油红O染色方法来检测分化程度。
将细胞固定在4% paraformaldehyde中，然后用60%异丙醇洗涤。
将油红O溶液添加到细胞上，染色20分钟后洗涤。
观察细胞内的红色油滴，这是脂肪细胞特有的特征。
5.RT-qPCR：利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）来测量脂肪细胞特异基因表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取总RNA，并合成cDNA。
使用特异性引物检测目标基因的表达水平，如脂肪细胞标记基因PPARγ和C/EBPα等。
6.蛋白质免疫印迹：用免疫印迹方法检测特定蛋白质的表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取蛋白质，并进行电泳分离。
将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，然后用特异性抗体检测目标蛋白质的表达水平。
7. 脂肪细胞代谢测定：应用适当的测定方法来评估脂肪细胞代谢特性。
例如，使用改良的AdipoRed（泛素酯类）试剂，它可以选择性地结合脂肪细胞中的甘油三酯，以测定细胞的脂肪含量。
8. 细胞迁移和侵袭实验：测量分化脂肪细胞的迁移和侵袭能力，以评估其功能。
骨髓单个核细胞体外培养诱导分化为脂肪细胞周芳;王金祥;李自安;刘菊芬;白盈盈;杨建勇;朱光旭;潘兴华【摘要】目的体外培养骨髓单个核细胞(BMNCs),并观察其成脂肪细胞分化能力.方法无菌取SD大鼠骨髓制作细胞悬液,差速贴壁法培养第三次贴壁细胞,传代扩增,取3～5代细胞用于实验.流式细胞分析检测CD34、CD44、CD45、CD90、CD144(VE-cadherin)和血管内皮细胞生长因子受体-2(KDR)表达;STEMPRO(R)Adipogenesis Differentiation Kit检测细胞成脂肪分化能力.结果通过差速贴壁法可获得相对单一的BMNCs,流式细胞分析表明培养的BMNCs 细胞表达CD34、CD44、CD45及CD90等表面标志,但不表达CD144和KDR;在未经诱导的情况下,培养的BMNCs能自发分化为脂肪细胞;培养BMNCs成脂肪细胞诱导后在第3、5、7d,成脂率分别为(22.4±3.8)％、(55.6±11.4)％以及(82.4±17.7)％,显著高于诱导培养第1 d[(1.3±1.1)％,P＜0.01].结论骨髓单个核细胞体外培养后可以诱导分化为脂肪细胞.【期刊名称】《西南国防医药》【年(卷),期】2016(026)012【总页数】4页(P1382-1385)【关键词】骨髓单个核细胞;间充质干细胞;脂肪细胞分化【作者】周芳;王金祥;李自安;刘菊芬;白盈盈;杨建勇;朱光旭;潘兴华【作者单位】650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室;650032昆明,成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R318.1人脂肪细胞在整个成年期都存在更新换代，具有脂肪分化潜能的干、祖细胞的持续性供应对于维持脂肪生成极其重要。
3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。
其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外
环境，使细胞经历特定的分化过程。
首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。
这一步骤有助于细胞增殖和发育。
接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添
加较低浓度的羊血清。
这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。
然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂
的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。
常用的诱导剂有一种混合物，包
括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。
这种物质可以诱导细胞内的转录因
子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到
关键作用。
最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征
从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。
这包括细胞膜的变化、细胞内
脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。
综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表
现出脂肪细胞特征。
间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学开发思路和流程干细胞是一种具有自我更新能力和多潜能分化的细胞，可以分化成为各种类型的细胞，包括脂肪细胞和骨细胞。
间充质干细胞（MSCs）是一种重要的干细胞类型，它们存在于各种组织中，如骨髓、脂肪组织和胎盘组织等。
间充质干细胞成脂成骨分化的实验方法学开发，是生物医学研究中一个重要的课题。
本文将从方法学开发的思路和流程入手，对间充质干细胞成脂成骨分化实验方法学进行探讨。
一、研究背景间充质干细胞成脂成骨分化是指间充质干细胞在一定的诱导条件下分化为脂肪细胞或骨细胞的过程，这一过程在细胞生物学和再生医学领域具有重要意义。
成脂成骨分化的研究有助于深入了解骨质疏松症、骨折愈合和脂肪代谢等疾病的发病机制，同时也为干细胞治疗提供了理论基础。
因此，开发一套可靠的实验方法学对于间充质干细胞成脂成骨分化研究至关重要。
1.确定分化诱导条件间充质干细胞在体外培养时，可通过添加不同的生长因子、细胞因子或药物来诱导其分化为脂肪细胞或骨细胞。
因此，确定最佳的分化诱导条件是方法学开发的第一步。
此过程需要考虑到诱导因子的种类、浓度、培养时间等因素，以及不同来源的间充质干细胞在分化过程中的差异性。
2.确定评价指标分化过程中，需要通过一系列的生物化学和分子生物学方法来评价间充质干细胞的脂肪细胞或骨细胞特征。
这些评价指标包括脂肪细胞的油红O染色、脂肪球形成实验，以及骨细胞的矿化实验、ALP染色等。
确定合适的评价指标对于评估分化效果至关重要。
3.确定实验方案在确定了分化诱导条件和评价指标后，需要制定详细的实验方案。
包括细胞的处理方法、诱导条件的优化、实验的时间节点等，以便后续实验的顺利进行。
1.间充质干细胞的提取和培养首先需要从适当的组织中分离和提取间充质干细胞，并进行细胞培养。
这一步需要注意细胞的纯度和活性，以保证后续实验的准确性。
2.分化诱导实验将培养好的间充质干细胞分别进行脂肪和骨分化诱导实验，根据预先确定的诱导条件进行处理。
⼲细胞成⾻、成脂、成软⾻诱导分化及检测三个⽅向诱导分化诱导⾻髓间充质⼲细胞成软⾻分化⼀、诱导⽅法将细胞悬液置于 50 mL聚苯⼄烯培养瓶(Nunclon)中培养。
完全培养基中加⼊能诱导MSCs 向软⾻细胞转化的诱导因⼦: (⼀致统⼀的诱导物质)转化⽣长因⼦β1 10ng/ml,（左旋）维⽣素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L)地塞⽶松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L）ITS 50mg/ml丙酮酸钠 1mmol/L亚油酸 5.35ug/mg⽜⾎清⽩蛋⽩ 1.25ng/ml。
倒置显微镜逐⽇（1－3 weeks）观察细胞⽣长情况。
细胞长成单层后进⾏传代。
细胞培养3周。
去除培养液,晾⼲,①细胞⽤通⽤Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美⽣物⼯程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作；②⽤alcian blue 孵育5 min, 流⽔冲洗2 min ,麦⽒苏⽊素复染5 min ,流⽔冲洗2 min ,晾⼲，显微镜下观察细胞的蛋⽩聚糖沉积。
或者⽤甲苯胺蓝染⾊，具体我也没做过，查到⼀篇⽂章中是这么说的：MSC成软⾻诱导后的甲苯胺蓝染⾊检测：培养不同时间的MSC培养⽫倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，⾃来⽔冲洗15min，双蒸⽔冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养⽫内，染⾊3h，加⼈95％⼄醇，洗去多余的染液，烘⼲，中性树胶封⽚。
诱导⾻髓间充质⼲细胞成⾻⽅向分化成⾻诱导培养: 取第 3代细胞, 接种⼊含体积分数为0.1 的新⽣⽜⾎清、0.1 µmol/L 地塞⽶松、50 µmol/L 抗坏⾎酸、10 mmol/L β- ⽢油磷酸钠的⾼糖 DMEM培养基进⾏成⾻诱导培养, 进⾏形态观察、功能检测。
间充质⼲细胞成⾻特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染⾊:取成⾻诱导 14 d 的细胞 , 40 g/L 中性甲醛固定 15 min, Gomori改良钙钴法染⾊。
取 5 块玻⽚, 每⽚随机取 2个视野, 采⽤⽹格计数法, 计算碱性磷酸酶染⾊阳性细胞的百分⽐。
Sigma(de)试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat16170-078/Lot 1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat 10437-028/Lot 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿, 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿.共6个10cm皿,将其中5个皿细胞冻存于-80°,将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿,待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80.二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化.两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d 开始加诱导剂,诱导方案严格按照之前计划(de)施行,诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d,后换诱导剂③培养,以后每48h换液,均采用诱导剂③,8天左右即可看到脂滴,此次整个诱导过程共用14天,出脂滴后继续48h换液,目(de)主要是获得更多(de)脂肪细胞.三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利,之前考虑到(de)诸如细胞可能贴壁不牢,易漂浮(de)情况基本未出现（漂浮很少）,诱导剂配置过程中由于剂量极低,担心(de)浓度不准问题,后证明对分化影响不是很大.一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制.分子量222,几乎不溶于水,现配现用,0.22um过滤除菌.100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH.每毫升培养基加10ul IBMX.2、胰岛素溶液配制.比较难溶,-20℃保存1个月,使用PH 2~3(de)稀盐酸溶液助溶,0.22um过滤除菌.100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL.每毫升培养基加10ul胰岛素.3、地塞米松溶液配制.分子量516.41,0.22um过滤除菌,-20℃保存1个月.使用无水乙醇溶解,1000×母液（1mmol/L）.1mg溶于25ml无水乙醇,每1ml加10ul.二、3T3-LI细胞系(de)培养、诱导1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中,37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度条件下培养,2d换液一次.2、3T3-Ll细胞系(de)诱导：细胞生长状态良好时实验.细胞传代分瓶,每一瓶中(de)细胞数约为1×105,每48h换液.当细胞接触抑制2d后,加入诱导剂 (10%胎牛血清FBS(de)高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素,1umol/L地塞米松,0.5mmol/L IBMX）,培养2d.然后换为10%胎牛血清(de)高糖DMEM培养液（含10ug/ml(de)胰岛素）,培养2d.改为10%(de)胎牛血清(de)DMEM培养液,每2d换液一直到诱导成为成熟(de)脂肪细胞(细胞体积增大,细胞中出现串状(de)脂肪滴),占总体积(de)90%.三、注意事项1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂.太早,细胞没有退出生长周期.太迟,细胞诱导后容易漂浮.2、3T3细胞株20代以后分化困难,最好挑选5代左右开始诱导分化.将细胞冻存起来,使用时再复苏.3、大约需要8~10天,可以诱导分化成功.之后换液处理需要轻缓,以免损失细胞.4、诱导前后使用油红O染色鉴定.证明是成熟脂肪细胞,而不是空泡样变性.方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合(de)红色染料,与未分化细胞和细胞外脂质不结合.吸弃培养板里(de)分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%(de)甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔,室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液,室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次,洗去未着色染料；显微镜下观察,照相.。
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm 皿分别传代3个10cm皿。
共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm 皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。
二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。
两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。
三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。
一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。
分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。
100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。
脂肪细胞分化和代谢的调控机制人类身体内的每一个细胞都有着分布不同的任务，其中，脂肪细胞作为能源储备的细胞，也具有其他生理功能。
脂肪细胞分化的过程被研究者们视为重要的体脂代谢调控机制，它对人体健康具有重要意义。
本文将分别从脂肪细胞分化和代谢两方面着手，探讨它们的调控机制。
一、脂肪细胞分化的调控机制脂肪细胞分化是由分化因子调控的一系列过程，其中最重要的两个因子是PPARγ和C/EBPα。
1. PPARγ的作用PPARγ是脂肪细胞分化的主要转录因子，它是一种核受体，可以结合到靶基因的PPRE区域，作用于转录起始位点，从而诱导脂肪细胞分化。
同时，PPARγ也是脂肪酸调控的重要因素。
在细胞中，PPARγ可以结合FABP4和CD36等脂肪酸转运蛋白，促进脂肪酸的摄取。
此外，PPARγ还能够参与到脂肪酸的β-氧化过程中，从而促进三酰甘油的分解。
2. C/EBPα的作用C/EBPα是脂肪细胞分化的另一个重要转录因子。
C/EBPα的表达水平在脂肪细胞分化初期会逐渐上升，最终促进脂肪细胞分化的完成。
此外，C/EBPα也能够诱导FABP4和CD36等脂肪酸转运蛋白的表达，从而促进脂肪酸的摄取和代谢。
脂肪细胞分化过程中，还涉及到Wnt、SREBP和TGF-β等家族的信号转导通路。
在不同的时间点，这些通路对脂肪细胞分化的调节作用也各不相同。
二、脂肪细胞代谢的调控机制1. β-氧化过程的调控β-氧化是脂肪酸的主要代谢途径，是三酰甘油分解过程中最关键的环节之一。
β-氧化的速率受到多种因素的调控，其中很重要的一点是亚细胞定位。
在线粒体内，脂肪酸需要先进入线粒体，被β-氧化酶所催化。
因此线粒体的数量和质量也影响着β-氧化的速率。
肌肉中，训练可以增加线粒体数量，从而促进脂肪酸的摄取和β-氧化。
此外，β-氧化的速率还受到内质网、细胞质中脂肪酰辅酶A水平和酒石酸循环的影响。
2. 脂肪酸摄取过程的调控脂肪酸的摄取受到肠道吸收和血液循环的影响，由此也影响着脂肪细胞内脂肪酸的存储量。
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)
Dexamethasone (Sigma D-4902)
Insulin (Bovine; Sigma I-5500)
gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)
胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)
培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）
MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)
一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。
共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。
二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。
两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h 换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。
三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。
一、诱导液配制
1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。
分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22um过滤除菌。
100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。
每毫升培养基加10ul IBMX.
2、胰岛素溶液配制。
比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，0.22um过滤除菌。
100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。
每毫升培养基加10ul胰岛素。
3、地塞米松溶液配制。
分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃保存1个月。
使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。
1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul。
二、3T3-LI细胞系的培养、诱导
1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO
2、饱和湿度条件下培养，2d换液一次。
2、3T3-Ll细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。
细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约为1×105，每48h换液。
当细胞接触抑制2d后，加入诱导剂(10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液（含10ug/ml
胰岛素，1umol/L地塞米松，0.5mmol/L IBMX），培养2d。
然后换为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（含10ug/ml的胰岛
素），培养2d。
改为10%的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液一直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90%。
三、注意事项
1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。
太早，细胞没有退出生长周期。
太迟，细胞诱导后容易漂浮。
2、3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。
将细胞冻存起来，使用时再复苏。
3、大约需要8~10天，可以诱导分化成功。
之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。
4、诱导前后使用油红O染色鉴定。
证明是成熟脂肪细胞，而不是空泡样变性。
方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。
吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。
