SAMHD1蛋白单克隆抗体的制备及SAMHD1在不同细胞中的表达鉴定

单抗制备流程1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术.这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备（一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定.1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip （腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。

5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv（静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1~50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂,ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。

通过 发挥 磷酸 水 解 酶 作用 降低 胞 内 的 ｄＮＴＰ水 平 ， 殖性肿 瘤 ，以淋 巴细 胞 在外 周 血 、骨髓 、脾 脏 和淋 巴
从 而达 到 限制 ＨＩＶ一１基 因 组 的反 转 录 ，抑 制感 染 的 结 聚集 为 特 征 。ＣＬＬ 是 欧 美 国家 最 常 见 的成 人 白
骨髓 瘤 、肺 癌 、皮 肤 Ｔ 细 胞 淋 巴瘤 等 人 类 的几 种 癌 括 自身免 疫 和 继 发 性 的 免疫 缺 陷 。ＳＡＭＨＤ１的突
症 中 已 经 得 到 证 实 ［１４－２３］。
变通 常 出现在 整 个 ＣＬＬ克 隆 中 ，它 是 ＣＬＬ克 隆进
化 的早 期事 件 ；ＳＡＭ ＨＤ１的分 子损 伤能 明显 减少 慢
基金 项 目 ：吉 林 省 教 育 厅 “十 二 五 ”科 学 技 术 研 究 项 目 吉 教 科 合 字 Ｅｇ０１ｓ］第 ３４９号
＊通 讯 作 者
性 淋 巴 细 胞 白 血 病 中 ｍＲＮＡ 和 蛋 白质 的 表 达 ； ＳＡＭＨＤ１的一 小部 分 突变 在 慢 性 淋 巴细胞 白血 病
中国实验诊断学 ２０１８年 １月 第 ２２卷 第 文 章 编 号 ：１００７—４２８７（２０１８）０１—０１７１— ０６
一
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ＳＡＭ ＨＤ１抗 肿 瘤研 究 进 展
岂 蕊 ，刘 盼 盼 。，娄 石 磊 ，苗 永 迪 ，孙 聪 ｈ
（１．长 春 中 医药 大学 基 础 医学 院 生 物 化 学 教 研 室 ，吉 林 长 春 １３０１１７； ２．吉林高新技术产业开 发区管理委员会招商一局 ，吉林 吉林 １３２０００）
ＳＡＭ ＨＤ１最 早 由曹 雪 涛 教 授 于 ２０００年 在 一 种 可 以 被 干 扰 素一丫（ＩＦ ７）诱 导 表 达 的 基 因Ⅲ１ ］。随后 的研 究 显 示 ，由 于 ＳＡＭＨＤ１与 ＡＧＳ 综 合征 （Ａｉｃａｒｄｉ－Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）相 关 ，又被 称 为 ＡＧＳ基 因 。ＳＡＭＨＤ１是 一 种 由 ６２６个 氨 基 酸 组 成 的核蛋 白（图 １），其 主要 包 含有 Ｎ一端 核 定 位信 号 区 （Ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ，ＮＬＳ）、不 育 ａ基

单克隆抗体制备之细胞融合细胞融合：⼴义上的细胞融合指两个或者多个细胞的原⽣质体融合形成⼀个杂种细胞的过程。

⼴义上的细胞融合可以是同种属的细胞发⽣，也可以是不同种属的细胞发⽣。

在单抗制备过程中的细胞融合专指瘤细胞与脾细胞的融合。

在介绍融合技术之前，有必要先了解⼀下⾻髓瘤细胞。

⾻髓瘤细胞的选择在前⾯概述部份就讲到，为了便于筛选出成功融合的杂交瘤细胞，需要选择DNA合成主要途径缺陷型的⾻髓瘤细胞（HGPRT-或TK-）与脾细胞融合，通常是HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

要得到这种细胞需要做两件事，第⼀是得到⾻髓瘤细胞，第⼆步是诱导和筛选出HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

⼀般可以通过向⼩⿏腹腔内注射碳氢化合物、⽯蜡或者油类物质⽽诱发其产⽣⾻髓瘤细胞，通常的做法是注射降植烷（Pristane，⼜称姥鲛烷）。

诱导出⾻髓瘤后，在⽆菌条件下取出此⾻髓瘤，⽤完全培养基培养⼀段时间后，再⽤8-氮杂鸟嘌呤或者5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸进⾏筛选即可得到HGPRT-的⾻髓瘤细胞。

对于第⼀步的诱导过程，⽬前只有BALB/C和N2B品系的⼩⿏才具有⾼度的敏感性。

⽬前最常⽤的⾻髓瘤是来⾃BALB/C⼩⿏的，为了减⼩远亲属种系之间的排斥反应，单抗制备中⽤来免疫的动物品系应该与⾻髓瘤来源的品系相同。

1972年，Potter第⼀次从Balb/C⼩⿏中分离⾻髓瘤细胞株MOPC,第⼀次⽤于脾细胞融合的⾻髓瘤细胞株为P3-X63-Ag8,简称X63或P3，它由Milstain 实验室将P3K(源⾃MOPC)细胞系经8-Aza筛选得到。

X63⾃⾝不能分泌完整的免疫球蛋⽩，但是可以合成并分泌γ1重链和κ轻链，因此如果⽤X63⾻髓瘤细胞与脾脏融合，得到的融合细胞除分泌脾细胞的抗体外，还可以分泌X63的γ1链和κ链。

后来⼜从P3K细胞系选育出另⼀变种P3-NS1-Ag4-1,简称NS-1,它不能合成γ1重链，能合成κ轻链，但是合成之后在细胞内降解⽽不能被分泌出来。

单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。

2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。

3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。

4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。

二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。

2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。

3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。

三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。

2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。

3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。

4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。

四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。

2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。

3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。

4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。

五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。

2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。

3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。

六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。

其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。

单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。