细胞融合与单克隆抗体优秀课件

Norwood提出，含15%（V/V）DMSO的50% PEG4000，DMSO可增加膜的通透性，使细胞膜的 渗透压更易于与环境趋于平衡，从而提高融合频率。
细胞融合前的准备（2）
制备饲养细胞（feeder cell）：小鼠腹腔巨噬细胞，能分 泌生长因子促使单个细胞容易生长，还能清除死亡破碎细 胞及微生物。
另一辅助途径是在H、T存在的情况下，经次 黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧 啶核苷激酶（TK）的作用合成DNA。
HAT培养基：
次黄嘌呤（hypoxanthine，H）
氨基蝶呤（aminopterin，A）:叶酸的拮抗剂， 可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA。
胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）
动物免疫：获得产生高效价特异性抗 体的B细胞
抗原：可溶性抗原（蛋白质、核酸、多肽、多 糖）、颗粒性抗原（细胞、细菌、真菌）。
可溶性抗原+佐剂
动物： 6周龄的雌性Balb/c小鼠
免疫途径：腹腔注射、静脉注射、皮内或肌肉内注射。 腹腔内注射尤其适合于颗粒性抗原；对于可溶性抗原 来讲，初次免疫一般选用弗氏佐剂和抗原的混合乳化 物进行背部皮下多点注射，加强免疫在首次免疫后 10～14天，一般是静脉或腹腔内注射，融合前还要进 行抗原冲击。脾内免疫法可获得更满意的免疫效果， 此法免疫周期短、抗原用量少 。
融合后五种细胞的命运：
B，瘤细胞（HGPRT缺陷），B-B，瘤-瘤（HGPRT 缺陷）， 瘤-B
B，B-B细胞能分泌抗体，含有HGPRT，能在HAT培 养基短期存活，但不能长期体外存活。
瘤细胞，瘤-瘤细胞能在体外长期存活，但不含有 HGPRT，不能在HAT培养基存活，不能分泌抗体。
只有瘤-B融合细胞具有亲代双方的遗传性能，在HAT 培养基存活，且能在体外长期存活，能分泌抗体。
14天，100 μg Cys C /只（0.2 ml）+ 等体积弗氏不完全佐 剂，大腿肌肉皮内多点注射；
21天，100 μg Cys C /只（0.2 ml），于小鼠腹腔注射；第 25天眼眶取血，分离血清，用ELISA试测定效价；
28天，选择效价达到要求（1：32000）的小鼠进行尾静脉 注射50 μg Cys C /只（0.05 ml），加强免疫。
不同商家、不同批次血清对细胞支持作用明显 不同，应筛选出能促进克隆细胞生长增殖的优 质血清，购置足够数量分装保存。
细胞融合——融合前的准备（1）
PEG的配制：PEG1000、1500、4000均可用于融合， 浓度为40%～50%。
50％聚乙二醇（PEG，MW4000）配制：
称取2 g PEG4000，放入青霉素小瓶内，盖上橡皮塞，插 上9号针头排气，沸水浴中30 min，使PEG融化并除菌； 待其冷却至50～60℃时，加入37℃预温的1640（1.7 ml） 和DMSO（0.3 ml）混合液，充分混匀，封口胶封紧瓶塞， 4°C 保存，用前可置37°C 加温助溶。
细胞融合——主要细胞系和培养基
骨髓瘤细胞：SP2/0，NS-1，均自Balb/c小鼠。 最好每隔3~6月将细胞置于含8-AG（8-杂氮鸟 嘌呤）的培养基中培养一次，已去除HGPRT+ 的细胞。
培养基：高糖DMEM，RPMI-1640
血清：
10%胎牛血清用于亲代细胞培养，融合、筛选、 克隆用20%胎0µg，一般不超 过200µg。
举例：
动物免疫：将纯化的Cys C蛋白（0.5 mg/ml）从86℃冰箱取出，冰上融解，抗原乳化采用三通管双注 射器互推法。
免疫方案：
0天首次免疫，100 μg Cys C/只（0.2 ml）+ 等体积弗氏 完全佐剂，背部、大腿肌肉皮内多点注射；
骨髓瘤细胞 + 小鼠脾细胞（经羊红细胞免疫）
持续分泌抗羊红细胞抗体的杂交瘤细胞
Nobel Prize in 1984
Ab的产生和单克隆抗体：
多克隆抗体
单克隆抗体 （monoclonal antibody, McAb）：针对一种抗原 决定簇的抗体。
Burnet选择学说：
一个淋巴细胞（B细胞） 只接受一个抗原决定簇 刺激，刺激后扩增的淋 巴细胞克隆只产生均一 的同质抗体，即单克隆 抗体。
细胞融合与单克隆抗体优秀课件
蔬菜水果杂交新品种
杂交水稻之父
动物杂交——斑马驴
狮虎兽
野牛和黄牛杂交
细胞融合的方法
病毒融合：副粘病毒最有效，副流感病毒、仙 台病毒等
神经氨酸酶
PEG融合：PEG导致脂质双分子层不稳定， 降低细胞膜极性，促进细胞膜融合。
电融合法：细胞膜出现微孔，通透性升高，继 发细胞融合。
体外要获得某种抗原的 单克隆抗体，需要有体 外持续分泌抗体的单一 B淋巴细胞克隆。
如何获得体外持续分泌抗体的细胞
能分泌抗体，不能长期在体外培养
survive
细胞融合和融合细胞的筛选是杂交瘤制备抗体的技术基础。
杂交瘤细胞的筛选——HAT培养基
细胞DNA合成有两条途径：
主要途径：糖、氨基酸合成核苷酸，叶酸作为 重要的辅酶参与。
于细胞融合前一天，取SPF 级健康Balb/c 小鼠，处死， 用75%酒精浸泡10 min，消毒小鼠体表。
将其移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用无 菌注射器吸取10 ml1640液注射入腹腔，用酒精棉球轻揉 腹部2～3 min；用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，吸 出腹腔液，放入10 ml离心管，1 000 rpm，离心10 min， 弃上清；
细胞融合是杂交瘤抗体技术 的基础。
二、鼠源性单克隆抗体制备
历史： Kohler and Milstein “Continuous Culture of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity”, Nature,1975.
杂交瘤技术制备McAb的原理
克隆选择学说
将抗原免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞在体外 进行细胞融合
用HAT培养基选择杂交瘤细胞的原理以及各种 细胞的命运
McAb制备主要流程
动物免疫
细胞融合
扩大培养制备大量McAb
克隆化
抗体特异性筛选
McAb制备主要步骤
动物免疫 细胞融合和筛选 抗体特异性筛选 克隆化 扩大培养