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文章编号:100025404(2002)0820895203论著大鼠严重烫伤早期应激反应中肝脏糖皮质激素受体变化的实验研究王军平1,粟永萍1,刘贤华1,赵景宏2,刘都户1,周艳红1,秦 荣3 (第三军医大学:1预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038;2附属新桥医院肾内科,3附属新桥医院普通外科,重庆400037) 提 要:目的 研究大鼠在严重烫伤早期应激反应中肝脏糖皮质激素受体(G R)的表达变化及意义,探讨影响G R改变的分子机制。
方法 通过免疫印迹分析G R在严重烫伤后早期不同时相点肝脏中的表达变化及烫伤血清、细胞因子以及高浓度地塞米松对体外培养肝细胞G R表达的影响;应用放免和E LIS A方法测定烫伤大鼠血清皮质酮和细胞因子T NF2α、I L21β的浓度变化。
结果 大鼠肝脏G R的表达在严重烫伤后早期显著下调,而血清皮质酮和血清炎性细胞因子在烫伤早期均显著升高,体外实验则证实烫伤血清和T NF2α、I L21对培养肝细胞G R的表达有明显抑制作用,高浓度地塞米松作用则不明显。
结论 严重烫伤会引起大鼠肝脏G R 表达显著下调,烫伤早期分泌增多的炎性细胞因子可能是引起G R下调的主要原因之一,而烫伤早期机体内部大量生成的糖皮质激素对G R的表达并无显著影响。
关键词:严重烫伤;糖皮质激素受体;肝脏;大鼠 中图法分类号:R392.13;R644;R977.11 文献标识码:AExpression of glucocorticoid receptor in the liver of severe scalded rats during the early stage of stressW ANGJun2ping,S U Y ong2ping,LI U X ian2hua,ZH AO Jing2hong,LI U Du2hu,ZH OU Y an2hong,QI N R ong(Institute of C ombined Injuries,Third M il2 itary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o investigate the change and significance of glucocorticoid receptor(G R)in the liver of severe scalded rats during the early stage of stress.Methods Western blot was used to detect the expressions of G R in the liver of severe scalded rats and the cultured hepatocytes after challenged with the serum from scalded rats,T NF2α,I L21or high concentration of dexamethas one respectively.The concentrations of corticos2 terone,T NF2αand I L21βin the serum of scalded rats were detected with RI A and E LIS A.Re sults The expression of G R in the liver was markedly declined,while the contents of corticosterone,T NF2αand I L21βin the serum were significantly elevated during the early stage of severe scalding.In vitro,the serum of scalded rats,as well as T NF2αand I L21,suppressed the expression of G R in the cultured hepatocytes,while there was no signifi2 cant effect of high concentration of dexamethas one on the expression of G R.Conclusion The expression of G R in the liver of rats is significantly down2regulated during the early stage of severe scalding,and one of the main reas ons for this might result from the elevation of in flammatory cytokines after scalding. K ey w ord:glucocorticoid receptor;liver;scalding;rats 糖皮质激素受体(G lucocorticoid receptor,G R)是糖皮质激素效应发挥的关键环节,在机体应激和抗炎反应中起着非常重要的作用[1]。
清热散瘀解毒方对EP性发热大鼠血清、下丘脑组织中cAMP含量的影响李祖金;樊静;陈孟溪;彭燕芬;徐晓丹;肖光辉【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2016(011)002【摘要】目的:通过观察清热散瘀解毒方对EP性发热大鼠cAMP的影响,探讨该方的退热机理.方法:应用随机分组方法将大鼠分为清热散瘀解毒方组(12只)、萘普生药物组(12只)、模型组(12只),每组注射2,4-二硝基苯酚进行小鼠非感染发热造模,然后分别灌入中药、西药、生理盐水(模型组和空白组).2h后测定体温及血清中cAMP的含量,比较分析不同药物对EP性发热大鼠体温的影响以及cAMP含量的变化.结果:中药组和西药组灌药2h后,体温明显低于模型组(P＜0.05);中药组、西药组血清和下丘脑cAMP含量明显低于模型组(P＜0.05).结论:清热散瘀解毒方能降低EP性发热大鼠体温,其作用机理可能与下调机体血清和下丘脑组织中cAMP含量相关.【总页数】3页(P305-307)【作者】李祖金;樊静;陈孟溪;彭燕芬;徐晓丹;肖光辉【作者单位】湖南中医药大学,长沙,410208;湖南中医药大学,长沙,410208;湖南中医药大学附属中西医结合医院,长沙,410006;湖南中医药大学,长沙,410208;湖南中医药大学,长沙,410208;湖南中医药大学,长沙,410208【正文语种】中文【中图分类】R289.5【相关文献】1.外感清热解毒方对发热大鼠血清炎症因子与下丘脑环氧化酶1和2蛋白表达的影响 [J], 平键;成扬;麦静愔;奚安;陈建杰2.清热散瘀解毒方对发热大鼠血清TNF-α、IL-1β、COX-2含量的影响 [J], 陈孟溪;廖敏;宋琳;张红;闾艳3.清热中药解热作用机理探讨—对大鼠下丘脑组织中cAMP含量的影响 [J], 徐刚;张冰4.脑热清对EP性发热家兔下丘脑及脑脊液cAMP含量的影响 [J], 岳晓莉;蒋玉凤;刘智勤;樊永平;王文荣;任丽薇;黄启福;胡以明5.脑热清对EP性发热家兔下丘脑、脑脊液cAMP及腹中隔区AVP含量的影响 [J], 刘智勤;蒋玉凤;岳晓莉;樊永平;王文荣;任丽薇;黄启福;胡以明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
前期研究发现，机械通气可上调花生四烯酸（AA ）代谢途径关键限速酶胞质型磷脂酶A2（C-PLA2）活性使肺内AA 及其致炎性代谢产物生成增加继而引起VILI ，而七氟醚可通过阻断上述病理过程发挥其抗VILI 保护作用［1,2］，但机械通气及七氟醚调控C-PLA2的具体机制尚未完全阐明。
由于细胞内钙离子浓度的增加是C-PLA2活化必不可少的条件［3］，而TRPV4作为一种位于细胞膜上的钙离子通道，可被机械力直接激活［4］，活化的TRPV4可上调C-PLA2表达继而引起高血压小鼠动脉内皮细胞收缩［5］。
体外实验研究发现，机械通气可激活TRPV4造成肺屏障功能破坏［6］，而七氟醚可通过阻断瞬时受体电位钙离子通道发挥其心肌保护作用［7］。
据此我们推测机械通气所产生的机械力激活C-PLA2的具体机制与TRPV4有关，而七氟醚可通过阻断TRPV4/C-PLA2信号通路发挥其抗VILI 保护作用。
Sevoflurane alleviates ventilator-induced lung injury in rats by down-regulating the TRPV4/C-PLA2signaling pathwayWANG Wenfa 1,YANG Yong 2,WANG LI 3,GUO Xin 3,TIAN Lingfang 1,WANG He 1,HU Yuzhen 1,LIU Rui 31Department of Anesthesiology,Chuxiong Yi Autonomous Prefecture People's Hospital,Chuxiong 675000,China;2Experimental Center of Medical Function,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;3Department of Anesthesiology,First People's Hospital of Yunnan Province/Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology,Kunming 650032,China摘要：目的探讨七氟醚抗呼吸机诱导的肺损伤（VILI ）的保护作用机制。
柴芩解热颗粒对发热大鼠解热作用及血清TNF-ɑ、IL-1β、PGE_(2)、AVP表达水平的影响吴迪;王清;张殿文;李响;李伟【期刊名称】《北华大学学报:自然科学版》【年(卷),期】2023(24)1【摘要】目的观察柴芩解热颗粒对脂多糖(LPS)致热大鼠的解热作用及血清中肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)、白介素-1β(IL-1β)、前列腺素E_(2)(PGE_(2))及精氨酸加压素(AVP)表达水平的影响.方法将60只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组(生理盐水+灌胃蒸馏水)、模型对照组(LPS造模+灌胃蒸馏水)、小儿柴桂退热颗粒组(LPS 造模+灌胃3.6 g/kg小儿柴桂退热颗粒)和柴芩解热颗粒高、中、低剂量组(LPS造模+灌胃2.1 g/kg、1.05 g/kg、0.525 g/kg柴芩解热颗粒),每组10只.直肠测温确定各组大鼠温度变化;腹主动脉取血,分离血清,酶联免疫法(ELISA)检测TNF-ɑ、IL-1β水平;处死大鼠,取下丘脑,检测PGE_(2)、AVP水平.结果与模型对照组比较,柴芩解热颗粒高剂量组有显著的解热效果(P<0.01).柴芩解热颗粒高、中、低剂量组均可降低大鼠血清中TNF-ɑ、IL-1β的含量,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.001);柴芩解热颗粒低剂量组可降低大鼠下丘脑匀浆液中PGE_(2)的含量,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05);同时还能升高大鼠下丘脑匀浆液中AVP的含量,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论柴芩解热颗粒具有良好的解热作用,解热机制可能与TNF-ɑ、IL-1β、PGE_(2)及AVP有关.【总页数】5页(P53-57)【作者】吴迪;王清;张殿文;李响;李伟【作者单位】吉林省中医药科学院;吉林大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R915【相关文献】1.重连口服液对内毒素致热新西兰兔解热作用及对血清TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响2.香芩解热颗粒对2,4-二硝基苯酚致热大鼠的解热作用研究3.柴芩解热颗粒抗菌抗病毒作用的实验研究4.重连口服液对内毒素致热新西兰兔解热作用及对血清TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响5.清热消炎颗粒解热作用及对血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2影响的初步研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠内生致热原性发热时不同脑区精氨酸加压素和亮氨酸脑咖
啡肽含量的变化
李文
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】1994(000)003
【摘要】无
【总页数】1页(P249)
【作者】李文
【作者单位】无
【正文语种】中文
【相关文献】
1.冰茶栓对骨癌痛大鼠不同脑区亮氨酸脑啡肽和β内腓肽含量的影响 [J], 严继贵;王迎新;杨宇清;蔡晶晶;
2.大鼠内生致热原双相热各期不同脑区神经降压素含量的变化 [J], 张永和
3.大鼠LP和ET发热时不同脑区β-EN含量变化及其作用机理的探讨 [J], 张永和
4.大鼠内毒素性发热时不同脑区cAMP含量和腺苷酸环化酶活性的变化 [J], 邢德君
5.戊四氮致癫痫大鼠不同脑区神经肽Y和亮氨酸-脑啡肽的表达及其意义 [J], 陈琅;陈巧彬;邹漳钰;林立芳;沈晓丽;陈新;季晓林
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发热鼠造模方法2 发热模型动物发热模型的建立方法有很多种，最常见的主要是采用向动物体内注入脂多糖(LPS)、2,4 二硝基酚和酵母菌的方法制作发热模型。
2.1 脂多糖(1ipopo1ysaccharide，LPS)诱导的发热模型LPS是革兰阴性细菌内毒的活性成分，LPS有高度水溶性，是效应很强的细菌致热源。
LPS 由3个成分组成,最外层为特异性多糖,即菌体多糖,它是由几个单糖组成的许多个同样的重复单位连接而成,与细菌的侵袭力有关;中间是核心多糖(同一种属之间是相同的);内层是类脂A,它是一种特殊的糖磷脂,主要起毒性作用而无种属特异性[10]。
其诱导的发热表现为双相热或三相热,并伴有寒颤、精神萎靡和轻微腹泻等症状,与临床感染性炎症所致发热相似,是经典的炎性发热模型,常用于筛选解热药物并探讨炎性发热机制。
因为该模型具有自限性和耐受性,如在用于中药解热药效(一般起效较慢)的研究时，应在用LPS诱导发热之前即开始给药。
LPS诱导发热模型所用的剂量范围较大,从10～250 μg/kg 不等,其中较为常用的剂量是10 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg。
在探索LPS诱导大鼠发热的最佳剂量时,发现引起实验大鼠发热热势高、持续时间长的LPS 剂量为20 μg/kg[11]。
LPS诱导的大鼠发热模型的具体操作方法是先每日测量大鼠体温(肛温)2次,连续2日,取2次体温的平均值记为基础体温。
单次体温超过38 ℃或2次体温差超过0.5 ℃的动物剔除。
实验前6 h 禁食不禁水。
然后腹腔注射LPS(20 μg/kg 或80 μg/kg),诱发动物发热,注射LPS后每隔0.5 h 测1次体温,连续监测8 h。
2.2 2,4-二硝基酚诱导的发热模型2,4-二硝基酚可刺激细胞氧化过程，抑制磷酰化过程，使氧化过程受到刺激所增加的能量不能通过磷酰化转变为三磷酸腺苷或磷酸肌酸的形式贮存而以热能散发，引起发热。
2,4 二硝基酚用于制作动物发热模型时，所使用的实验动物多为大鼠或家兔。
脂多糖对大鼠下丘脑室旁核GABABR1阳性神经元的激活作用【摘要】目的：探讨大鼠下丘脑室旁核(PVN)�舶�基丁酸B受体亚单位1(GABABR1)阳性神经元对脂多糖(LPS)刺激的反应. 方法：将大鼠腹腔注射LPS建立免疫应激模型，对照组注射等量的生理盐水，采用免疫荧光双标记与激光共聚焦显微镜技术，观察大鼠下丘脑室旁核内神经元Fos和GABABR1的标记情况以及它们在同一神经元内是否有共标记. 结果：腹腔注射LPS可使大鼠PVN内表达Fos神经元数量显著增高，且PVN内部分神经元可同时被Fos和GABABR1双重标记，双重标记的神经元大约占Fos神经元的30%，占GABABR1的24%. 结论：下丘脑室旁核部分GABABR1阳性神经元参与了LPS诱导的免疫应激反应，它们可能在下丘脑�泊固濯�肾上腺轴的调节方面起重要作用.【关键词】脂多糖类基因Fos γ��氨基丁酸B受体亚单位1(GABABR1) 荧光抗体技术下丘脑室旁核(PVN) 应激0引言脂多糖(LPS)进入机体能够诱导免疫细胞分泌炎性细胞因子，激发机体的免疫应激反应，动物注射LPS是研究免疫系统和神经系统之间关系的常用模型［1］. γ�舶被�丁酸（GABA）是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，通过离子型受体GABAAR和代谢型受体GABABR发挥作用［2-3］. GABABR包括GABABR1和GABABR2两个亚型，其中GABABR1是受体的主要部分［2］. 下丘脑是人体神经内分泌及自主神经系统的整合中枢，室旁核（PVN）是下丘脑内的重要核团，它通过下丘脑�泊固濯采�上腺轴等途径参与各种应激反应的调节［4］. 以往的研究［5-6］表明，在下丘脑PVN内有表达GABABR1的神经元. 另一方面，LPS刺激可引起PVN神经元表达Fos［7-8］，说明PVN神经元参与由LPS激发的免疫应激反应的调节，但LPS是否激活PVN内GABABR1阳性神经元尚缺乏直接的证据，我们对此进行研究以阐明GABA及其受体在下丘脑对免疫应激反应的影响.1材料和方法1.1材料健康成年SD雄性大鼠12只，体质量200～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 兔抗Fos抗体(Sigma公司)；豚鼠抗GABABR1抗体，得克萨斯红结合的羊抗兔IgG，异硫氰酸荧光素（FITC）结合的驴抗豚鼠IgG(Chemicon 公司)；Leica 1800恒冷箱切片机（德国莱卡公司）； FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）.1.2方法1.2.1动物模型的建立及切片制备动物购入后置于安静、温暖(25℃左右)、避强光和自由摄食的环境中饲养48 h，避免非特异性应激反应的发生. 将动物随机分为实验组（6只）和对照组（6只）. 于8∶00点在大鼠清醒状态下，对实验组大鼠迅速腹腔注射300 μL生理盐水溶解的LPS，250 g/kg；对照组注射等剂量的生理盐水. 两组动物在上述相同环境中放置3 h后，用过量10 g/L戊巴比妥钠(>40 mg/kg)深度麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 mL生理盐水洗去血液，继用含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.4，4℃)先快后慢灌流固定，取出全脑置于相同的灌注液中后固定4～6 h，然后将材料移至含300 g/L蔗糖的PB内，4℃保存直至组织沉底. 恒冷箱切片机切制含PVN［9］的间脑连续冠状切片，片厚30 m，切片共分5套，分别用于Fos，GABABR1单标记和双标记以及对照，另一套做备用. 切片收集于盛有0.01 mol/L PBS的网格内，PBS洗3次×10 min，待用.1.2.2免疫荧光双标记染色将兔抗Fos抗体(1∶500)和豚鼠抗GABABR1抗体(1∶1000)用含10 g/L小牛血清白蛋白和1 g/L Triton X��100的0.01mol/L PBS混合后常温孵育切片24 h，用0.01 mol/L PBS洗3次×10 min，然后用得克萨斯红交联的羊抗兔IgG(1∶500)和FITC交联的驴抗豚鼠IgG(1∶500)混合液常温孵育切片2 h，用0.01 mol/L PBS洗3次×10 min，将组织切片贴于载玻片上，自然凉干，用含500 g/L甘油的0.01 mol/L PBS封片. 单标记过程同上，抗体用相应的组套. 在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像.1.2.3对照实验除一抗用正常的血清白蛋白代替外，其他程序与上述过程相同，正常血清孵育的组织片上检测不到Fos和GABABR1免疫阳性神经元.统计学处理：每只大鼠在含PVN前、中、后平面上各选取3张切片，计数单标记和双标记的神经元数量，取每组6只的平均值. 结果以x±s表示，用SPSS13.0对组间差别进行t检验，P<0.05表示有统计意义.2结果2.1GABABR1在下丘脑室旁核的标记GABABR1阳性产物见于神经元胞膜和胞质内，标记的神经元发出明亮的绿色荧光，细胞轮廓清楚，胞核未染，细胞形态多呈圆形，突起不明显（图1A，B）. 阳性神经元较多地分布在下丘脑PVN外侧大细胞部，并向内延续到小细胞部及腹侧部，但数量逐渐减少、染色强度逐渐减弱. 虽然LPS组的GABABR1阳性神经元数较对照组稍多、有些神经元染色较重，但两组之间的差异无统计学意义（图2）.2.2Fos在下丘脑室旁核的标记Fos阳性神经元发出明亮的红色荧光，阳性产物限于胞核内，胞核深染、圆形，边缘光滑，胞质未染色，因而树突、胞体未显示. 对照组大鼠Fos仅有零星散在分布（图1C）. LPS组Fos阳性神经元主要见于下丘脑PVN内侧小细胞部和腹侧部，在外侧大细胞部也有少量分布（图1D）；LPS实验组的Fos阳性神经元数量显著增多，常是对照组的数倍，两组比较差异显著(P<0.01，图2).2.3Fos/GABABR1双标神经元在下丘脑室旁核的标记在Fos和GABABR1双标记的切片中可以看到3种类型的标记细胞：发出明亮红色荧光的Fos神经元、发出明亮绿色荧光的GABABR1神经元和Fos/GABABR1 双标记神经元. 双标的特点为在同一神经元内，胞质为GABABR1阳性发出的绿色荧光，胞核为Fos阳性发出明亮的红色荧光（图1E~G）. 在LPS组，Fos/GABABR1双标神经元主要分布于下丘脑PVN的外侧大细胞部与小细胞部交界处以及PVN腹侧部. Fos/GABABR1双标细胞数量分别约占Fos和GABABR1单标细胞数量的30%和24%. 对照组少见双标细胞，无分布规律（图1E）. 两组大鼠下丘脑室旁核各种类型标记细胞计数结果见图2.3讨论在LPS刺激引起的应激反应中，神经、内分泌和免疫系统三者之间相互作用、相互影响，最终达到恢复维持机体内环境的稳定. 在此反应过程中，下丘脑�泊固濯采錾舷僦�起关键作用［10-11］. 以往的研究［10］指出，全身或中枢急性注射LPS可以增加下丘脑PVN内肾上腺素释放激素(CRF) mRNA及CRF的水平，而损毁下丘脑后则不会发生此种情况，因此认为LPS可激活下丘脑�泊固濯采錾舷僦�，并认为激活的起始点在PVN. 在本实验中，我们发现腹腔注射LPS后，PVN内有大量的表达Fos的神经元，阳性神经元主要分布在内侧小细胞部和腹侧部，进一步证实LPS对下丘脑的激活作用. 这个结果与以往的研究结果基本一致［7-8］. LPS对下丘脑神经元激活的途径目前还不完全清楚，可能是通过刺激巨嗜细胞分泌细胞因子，如TNF�拨粒�IL��1，IL��6等对PVN神经元直接作用［10，12］，或者是通过外周内脏感觉神经系统传导到延髓内脏带，再传导至PVN而发挥作用［10，13］.A，C，E: 生理盐水对照组； B，D，F，G: LPS实验组. 图G为一双标记高倍放大图，箭指示双标细胞，分叉箭指示Fos阳性，三角箭头指示GABABR1阳性细胞. 标尺：A~F=50 μm；G=20 μm.图1共聚焦免疫荧光显微照片显示大鼠下丘脑室旁核内GABABR1(A，B)，Fos(C，D)和Fos/GABABR1(E，F，G)双标细胞的分布bP<0.01 vs 对照组.图2两组Fos，GABABR1和Fos/GABABR1阳性神经元在PVN每张切片上的平均数量对比形态学研究表明PVN内有大量的GABA神经终末，这些GABA能纤维可能来源于下丘脑局部或终纹床核等［14］. 近来的研究还指出PVN内既有GABAAR，也有GABABR［5-6］. 生理学和形态学实验还显示两类受体都存在于PVN的CRF神经元或分泌加压素(VP) 神经元上［5-6，15 ］. 而此两种神经元在下丘脑垂体�采錾舷僦岫�LPS诱导的免疫应激反应中又起重要作用［10-11］. 但以往没有直接证据说明PVN内表达两种受体的神经元直接参与了LPS诱导的免疫应激反应. 本实验中，我们给动物腹腔注射LPS，在下丘脑PVN内观察到许多既是Fos阳性、又表达GABABR1的神经元，首次证明了GABABR1参与了由LPS的诱导的免疫应激反应. 我们最近的实验也证明了GABAAR1也参与了这个反应［16］. GABA受体阳性神经元参与免疫应激反应的意义可能在于，这些神经元通过接受机体的应激信息而激活，从而抑制丘脑�泊固濯采�上腺轴的过度兴奋，减轻机体对LPS刺激的过强反应，维持机体内环境的稳定，起到了机体保护作用. 其中GABABR1属于代谢性受体，可能较GABAAR在此过程中发挥更加持久的作用.虽然GABABR1阳性神经元与Fos阳性神经元的分布区域主要在内侧小细胞部与外侧大细胞部延续处重叠，并有一定数量的双标记细胞，但两者的主要分布上存在一定的差别，Fos阳性神经元主要密集分布于PVN内侧小细胞部，而GABABR1阳性神经元更多地分布在外侧大细胞部，说明参与LPS刺激所致的急性应激反应的神经元还有很大部分不含GABABR1，这些神经元所含的受体，还有待进一步研究.【参考文献】［1］ Maier SF. Bi directional immune��brain communication: Implications for understanding stress， pain， and cognition［J］. Brain Behav Immun， 2003，17:69-85.［2］ Billinton A， Ige AO， Bolam JP， et al. Advances in the molecular understanding of GABAB receptors［J］. Trends Neurosci，2001，24(5)：277-282.［3］ Macdonald RL， Olsen RW， GABAA receptor channels［J］. Annu Rev Neurosci， 1994，17:569-574.［4］ Hadid R， Spinedi E， Chautard T， et al. Role of severalmediators of inflammation on the mousehypothalamo��pituitary��adrenal axis response during acute endotoxemia［J］. Neuroimmunomodulation， 1999，6:336-343.［5］ Richards DS， Villalba RM， Alvarez FJ， et al. Expression of GABAB receptors in magnocellular neurosecretory cells of male， virgin female and lactating rats［J］. J Neuroendocrinol，2005，17:413-423.［6］ Li D，Pan H. Role of γ��Aminobutyric Acid (GABA)A and GABAB receptors in paraventricular nucleus in control of sympathetic vasomotor tone in hypertension［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2007，320:615-626.［7］杨志军，葛熙，饶志仁，等. Fos蛋白在LPS免疫激发大鼠脑内的分布［J］. 解剖学报，2000，31：292-295.［8］袁祥鹏，鞠躬. 多克隆免疫激发剂LPS免疫激发大鼠引起下丘脑和脑干c��fos表达［J］. 解剖学报， 1997，28:137-141.［9］ Paxinos G， Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates［M］. Compact 3rd ed. San Diego: Academic Press， 1997:86-89.［10］ Beishuizen A， Thijs LG. Endotoxin and thehypothalamo pituitary��adrenal(HPA) axis［J］. J Endotoxin Res，2003， 9:3-24.［11］路翠艳，潘芳. 应激反应中HPA轴的中枢调控和免疫调节［J］. 中国行为医学科学， 2003，12:353-355.［12］ Johnson JD， OConnor KA， Watkins LR， et al. The role of IL��l beta in stress��induced sensitization of proinflammatory cytokine and corticosterone responses［J］. J Neurosci，2004，127：569-577.［13］ Yang ZJ， Rao ZR， Ju G. Evidence for the medullary visceral zone as a neural station of neuroimmunomodulation［J］. Neurosci Res， 2000，38:237-247.［14］ Decavel C， van den Pol AN. GABA: A dominant neurotransmitter in the hypothalamus［J］. J Comp Neurol，1990，302:1019-1037.［15］ Cullinan WE. GABAA receptor subunit expression within hypophysiotropic CRH neurons: A dual hybridization histochemical study ［J］. J Comp Neurol， 2000， 419:344-351.［16］袁莲芳，赵钢，贾宏阁. 下丘脑室旁核GABAARα1阳性神经元参与内毒素诱导的免疫应激反应［J］. 神经解剖学杂志，2008，24(3): 266-270。
在LPS致大鼠发热过程中下丘脑TRPV4对体温及cAMP含量、［Ca2＋］i浓度的影响1王兰兰，王乐，曹宇*中国医科大学基础医学院生理学教研室,沈阳（110001)E-mail：caoy5955@摘要：目的探讨TRPV4在发热时是否参与体温调节过程。
方法用脂多糖复制大鼠发热模型，结合应用钌红抑制TRPV4的活性，观察发热时的下丘脑组织中TRPV4含量、钙离子浓度变化与cAMP含量的关系。
结果单独给予钌红组体温降低，钌红＋LPS组与LPS组△、cAMP与［Ca2＋］i增高幅度均降低，钌红组与钌红＋LPS组TRPV4表达明显相比，T低于对照组。
结论 1.TRPV4通道可能参与正常体温的维持；2. LPS致大鼠发热可能是通过激活TRPV4通道，使钙离子内流增多，进而中枢发热介质cAMP表达增多，从而引起体温升高来实现的。
关键词：发热；TRPV4；脂多糖；环磷酸腺苷；［Ca2＋］i近年研究认为，cAMP是EP性发热的主要中枢介质，此外下丘脑中钙离子的浓度变化在发热中所起的作用也日益受到关注，但具体机制还不清楚。
TRPV4是瞬时感受器电位香草酸受体家族的成员之一，能被27℃以上的温热刺激激活[1],是一个非选择性阳离子通道，被激活时可产生一个较大的钙离子内流[2、3]。
研究发现TRPV4在下丘脑前部表达较多[4]，这一区域是主要的体温调节中枢，表明TRPV4可能在体温调节中起一定作用。
本实验通过用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）复制大鼠发热模型，结合应用钌红（ruthenium red，RR）抑制TRPV4的活性，观察发热时下丘脑组织中TRPV4含量、钙离子浓度变化与cAMP含量的关系，以探讨TRPV4在发热时是否参与体温调节过程。
1.材料与方法1.1 实验动物与分组健康♂ SD大鼠,体重200～250 g,由中国医科大学实验动物中心提供,室温(22 ±2) ℃,昼夜明暗节律12 h ∶12 h,基础体温(3715 ±110) ℃,单笼饲养,自由进食水。
实验所用试剂均用无热源生理盐水稀释。
实验前对大鼠进行测温服习7 d。
测量体温时将温度探头插入大鼠直肠6 cm处,待数值稳定后读数,以给药前1 h测得的3次直肠温的平均值为大鼠基础体温。
实验过程中记录大鼠体温(0～1 h内每隔15 min, 1～2 h内每隔30 min, 2～8 h内每隔60 min测量1次) 。
实验结束后检查插管位置,舍掉位置不正确的数据。
实验分组：将48只大鼠随机分成4组，每组12只。
对照组（N）：向侧脑室注入NS 10 µl，30 min后经腹腔注射NS 80 µg/Kg。
钌红组（R）：方法同N组，分别注射相同剂量的RR(Sigma公司产品）和NS。
LPS发热组（L）：方法同上，分别注射相同剂量的NS和LPS （武汉博士德公司产品）。
钌红＋LPS组（R+L）：方法同上，分别注射相同剂量的RR和LPS。
上述各组中随机选取6只动物在腹腔注射生理盐水或LPS后240 min时断头取材，以备1本课题得到国家自然科学基金资助项目（No30270198）；高等学校博士学科点专项科研基金（No2006159004）的资助。
进行各种生化指标的检测。
按大鼠脑图谱以灰结节和视交叉的中心点为界定部位，取出下丘脑组织，一部分立即进行细胞内钙离子浓度测定，一部分立即投入液氮中速冻固定，20 min 后放入－70℃冰箱内待测；另外6只动物持续观察480 min，并描绘其体温变化曲线。
1.2 侧脑室插管将大鼠用10％水合氯醛（3 ml/kg)腹腔麻醉，然后将其头部固定于立体定位仪上，暴露前囟。
参照大鼠脑图谱，用探针在颅骨表面冠状缝下1.5 mm，矢状缝旁开0.8 mm处钻孔，将外径为1 mm的引导管插入一侧侧脑室，用牙托水加牙科水泥固定导管。
术后动物单笼饲养，恢复一周后进行实验。
1.3 下丘脑中cAMP含量的测定取预存的下丘脑组织50 mg，加2 ml冰醋酸，进行匀浆，3000 r·min- 1离心15 min，取上清，在60℃水浴中用氮气将上清吹干，之后按照cAMP放免检测试剂盒（上海中医药大学同位素室提供）说明书进行测定。
1.4 采用Western blotting方法检测大鼠下丘脑组织TRPV4表达取大鼠下丘脑组织，冰浴匀浆，4℃离心12 000 r·min- 1，15 min,取上清，再进行蛋白定量之后，进行电泳，转膜，封闭，加抗TRPV4抗体(Sigma公司产品) ，稀释倍数1∶200，二抗为羊抗兔IgG(武汉博士德公司产品) ，DAB显色。
1.5 下丘脑细胞内钙离子浓度测定各实验组大鼠于发热高峰时立即断头取脑，1 min内取出新鲜下丘脑组织，立即置于4℃的D－Hanks液中剪碎并洗2～3次，后置于等体积，浓度为0.25%的胰酶中，37℃恒温水浴消化30 min，消化过程中轻轻吹打。
加入4℃的D－Hanks 液(含10％的小牛血清) 3 ml终止消化，过200目筛网(至小烧杯内)，滤液以800 r·min- 1离心2次，每次5 min，弃上清，沉淀物中加D －Hanks液2 ml。
台盼蓝排斥实验检查，细胞存活率须在95%以上，并调整细胞数为(106～107 ·ml- 1 ) 。
Fura2 /AM用纯二甲基亚砜(DMSO)配成50µg·mL - 1的储备液，- 20℃保存备用。
取上述细胞悬液1 ml，预温5 min后，加入5µl Fura2 /AM ，37℃恒温避光孵育负载45 min，负载后细胞用D－Hanks液洗2次，以1000 r·min- 1离心2次，每次5 min，弃上清，加入D－Hanks 液定容至1 ml。
采用日立F3 000型荧光双波长分光光度计测定，激发波长为340 nm、380 nm，发射波长为510 nm。
根据下面公式可计算[ Ca2 + ] i。
[Ca2 + ]i = Kd ×(R - Rmin ) / (Rmax - R ) ×F2min /F2max( nmol·L - 1 ) 。
Kd 值为224 nmol·L - 1 , R 为荧光值, [ Ca2 + ] i 为nmol·L - 1。
F2 min为加入EGTA 后测得的荧光值,，F2 max为加入TritonX－100后测得的荧光值[5]。
1.6 统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数±标准差（x±s）表示，各组均数间差异性的比较用t检验，相关分析用相关性检验分析法。
2. 结果2.1各实验组大鼠的体温变化Fig 1显示了在不同处理因素条件下体温变化曲线，可见钌红组与对照组比较各时间点的△T 明显降低，有统计学意义（P<0.01）。
给大鼠腹腔注射LPS 可引起体温升高，于240 min 左右达到高峰，与对照组比较有显著差异（P<0.01）。
钌红＋LPS 组的体温也出现明显升高，于300 min 左右达到高峰。
与对照组比较差异显著（P<0.01）；与LPS 组比较，发热高峰右移，发热幅度略有降低，在60 min ～300 min 期间△T 差异显著（P<0.05）。
Fig 1 The mean curve of rat body temperature response in various group(n=6,x ±s). *P ＜0.05,**P ＜0.01vs control group; # P<0.05, # # P<0.01vs L group .2.2下丘脑组织cAMP 含量的变化Tab 1显示各实验组于240 min 断头取材，测得的cAMP 含量。
LPS 组下丘脑中cAMP 的含量与对照组比较明显增加，约增加1.5倍，钌红＋LPS 组的cAMP 含量与LPS 组相比明显减少（P<0.05），而与对照组比较也明显增加（P<0.01）。
cAMP 含量的变化与体温的变化呈正相关(r=0.692，P<0.01)，Y=3.6376X －1.1455。
Tab 1 Content of cAMP in hypothalamus at 240 minute of rats at different conditions (n=6, x ±s)Group NcAMP N 60.35 ±0.05 L 60.56 ±0.54 R+L 60.48 ±0.06 R 60.37 ±0.12 P ＜0.05,P ＜0.01vs N group;P<0.05,P<0.01 vs L group .2.3下丘脑组织细胞内钙离子浓度的变化Tab 2显示各实验组于240 min 断头取材，测得的细胞内钙离子浓度值［Ca 2＋］i 。
可见****钌红组下丘脑细胞中Ca 2＋浓度与对照组相比显著减少（P<0.05），LPS 组下丘脑细胞中Ca 2＋浓度与对照组相比显著增加，（P<0.01）；钌红+LPS 组的Ca 2＋浓度与对照组相比也显著增加，（P<0.05），与LPS 组相比减少（P<0.05），有统计学意义。
Tab 2 The concentration of intracellular calcium in hypothalamus at 240minute of rats at different conditions(n=6，x ±s)Group N［Ca 2＋］i N 6 277.97 ±21.95 L 6350.25 ±28.81 R+L 6312.90 ±18.84 R 6239.66 ±14.10 P ＜0.05,P ＜0.01vs N group;P<0.05,P<0.01 vs L group .2.4下丘脑组织TRPV4表达的变化在下丘脑组织中TRPV4的表达水平在LPS 组与对照组比较明显升高（Fig 2），而钌红+LPS 组、钌红组TRPV4的表达明显低于对照组。
说明钌红除具有抑制TRPV4通道的开放的作用外，还能抑制TRPV4的表达。
Fig 2 The expression of TRPV4 in hypothalamus in different groups2.5下丘脑组织［Ca2＋］i 与cAMP 含量变化的相关分析LPS 致发热过程中，在达到体温高峰时，下丘脑中［Ca 2＋］i 与cAMP 的含量变化之间呈正相关（r= 0.709, P<0.01），Y=0.0017X －0.0629 (X 为［Ca 2＋］i ，Y 为cAMP 含量)。
