小鼠肝细胞的分离培养

小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。

2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。

将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。

3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。

当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。

4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。

同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。

通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。

该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。

小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用近年来，小鼠肝细胞在许多生物医学研究中扮演着至关重要的角色。

小鼠肝细胞培养是研究肝功能和疾病发生机制的重要手段，但它的成功与否则依赖于培养方法的质量和有效性。

因此，本文将探讨小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用。

一、小鼠肝细胞培养的基本要素在小鼠肝细胞培养前，我们需要对一些基本要素有所了解。

首先是培养基的选择，培养基中的主要成分包括营养元素、生长因子、血清和抗生素等。

其次是小鼠肝细胞的来源，可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。

最后是培养环境的控制，包括温度、CO2浓度、湿度等因素。

基于以上要素，我们可以通过以下几个方面来优化小鼠肝细胞培养方法。

二、培养基的优化培养基中的营养元素和血清等因素的浓度会影响细胞的代谢和增殖。

经过不断的调整和改进，研究人员发现一些培养基组合能够更好地维持小鼠肝细胞的代谢需求和增殖能力。

例如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）添加适量的生长因子（如表皮生长因子、胰岛素样生长因子和基质金属蛋白酶）和血清可有效提高小鼠肝细胞培养的成功率和长期维持细胞的质量。

三、小鼠肝细胞来源的优化小鼠肝细胞的来源通常可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。

一般来说，从小鼠肝组织取得肝细胞可获得更好的细胞活性和代谢能力。

特别地，通过胆汁灌注分离法得到的小鼠肝细胞，更为有效和高质量。

四、培养环境的优化培养环境中的温度、湿度和CO2浓度等因素对小鼠肝细胞的生长和代谢都会产生影响。

一般情况下，20-25°C的室温、5%CO2浓度和相对湿度在50-70%之间是最为适宜的条件。

在细胞培养过程中，应尽可能避免一些较大的生理环境波动，以维持细胞充足的营养和稳定的代谢水平。

总之，小鼠肝细胞的培养方法优化能够提高小鼠肝细胞的长期保存能力和维持其正常生理和代谢状态。

在生物医学领域的广泛应用中，小鼠肝细胞培养将为寻找肝疾病的防治策略和治疗方案提供更多的科学依据。

小鼠HSCs 的分离1) 实验前准备：37℃水浴锅内预热D-HanK’s溶液、HBSS溶液(含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶)及含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶和20 μg/mL 的DNA 酶的HBSS 溶液；2) 小鼠准备：取体重约25~30 g 的雌性Colgalt2-/-小鼠与Colgalt2+/+小鼠，禁食12 h，自由饮水；3) 麻醉与固定：腹腔注射8‰的戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后固定在超净台内，75%乙醇消毒腹部；4) 依次切开小鼠皮肤、腹膜后暴露腹腔，将小鼠胃肠移至腹部左侧，充分暴露门静脉和下腔静脉。

整个过程均按照手术无菌原则执行；5) 自门静脉远端刺入静脉输液针，另一端连接50 mL 注射器，注射预热的D-HanK’s 液。

确定插入成功后，剪开下腔静脉。

以7-10 mL/min 的速度灌注D-HanK’s 液，灌注约30 mL。

观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后停止灌注；6) 开始灌注预热的含IV 型胶原蛋白酶的HBSS 溶液，速度为3-5 mL/min，灌注10 min 左右。

直至肝脏变软、变脆，肝脏表面呈现裂隙状，压之凹陷不易恢复时结束灌注；7) 摘除胆囊后，剪断门管区韧带和镰状韧带，取下肝脏，放入无菌平皿中。

生理盐水冲洗，剔除肝包膜、血管及纤维结缔组织；8) 剪碎肝组织及震荡消化：将肝组织剪成小碎块，加入已配制好的HBSS液20 mL(含0.3 mg/mL的IV 型胶原酶和1 μg/mL的DNAase I)，37 ℃条件下震荡消化25 min；9) 用200 钼的滤网过滤，1500 g 离心7 min，弃上清；10) 20 mL 冰的不含FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬，500 g 离心5 min。

弃去沉淀，即去除肝细胞；11) 离心上清液，1500 g，7 min，吸取沉淀（即肝非实质细胞）；12) 加入2 倍体积的18%Nycodenz离心液，混匀后，小心加入冷的不含FBS的DMEM (约2 mL)；13) 离心：2600 g，22 min。

一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程小鼠肝脏是重要的免疫细胞来源地之一，其免疫细胞种类繁多，包括各类淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

因此，高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞对于免疫学研究具有重要意义。

下面将介绍一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程。

一、试验动物的选取首先需要选择健康的小鼠作为实验动物。

通常可以选择8-12周龄、体重20-25g的小鼠进行实验。

此外，实验前需要确保小鼠处于良好的生理状态，无任何疾病或感染。

二、材料准备1.小鼠静脉采血脉管采血针及离心管2.无菌手术器械3.生理盐水4.乙醚5. 70%乙醇6.无菌培养皿和离心管三、操作步骤1.术前准备将实验所需材料进行无菌处理，保证操作环境无菌。

2.麻醉利用乙醚对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，进行下一步操作。

3.打开腹腔将小鼠放在无菌操作台上，采用无菌手术器械进行皮肤消毒和切开小鼠腹腔。

4.采集肝脏在麻醉状态下，将小鼠的肝脏从腹腔中取出放入无菌盛皿中。

5.分离肝脏细胞将取出的小鼠肝脏放入含有生理盐水的离心管中，用离心机进行离心，将肝脏中的细胞分离出来。

6.细胞培养取出离心管中的肝脏细胞，放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，进行培养。

7.细胞鉴定通过显微镜检查培养后的细胞，进行鉴定和分析。

通过以上步骤，就可以高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞。

这种方法不仅简单易行，而且获取到的免疫细胞种类繁多，可用于免疫学研究中的各种实验。

在操作过程中，需要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。

同时，也需要尽量减少对小鼠的伤害和痛苦，符合动物实验伦理要求。

希望这种方法能对相关研究工作提供帮助，推动免疫学领域的进步。

小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。

肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。

因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。

一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。

贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。

单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。

这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。

三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。

二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。

在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。

其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。

细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。

其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。

细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。

同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。

三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。

目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。

原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。

本文将探讨原代肝细胞培养的方法。

原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。

它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。

原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。

首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。

一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。

然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。

常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。

这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。

接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。

一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。

在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。

此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。

然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。

首先，选择合适的培养基是非常重要的。

常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。

这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。

其次，细胞密度的控制也非常重要。

通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。

此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。

温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。

小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。

4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。

6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。

8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。

目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。

具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。

分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。

准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。

分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM和IV 型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。

注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。

小鼠肝细胞原代培养－消化法
1. 处死及消毒：脱颈处死小鼠, 浸入75%酒 精中1min, 沥干。
2. 取材：剪开腹部皮肤,撕开皮肤,暴露腹膜, 打开腹腔取出肝脏。
3. 解剖：修剪除去肝门区血管结缔组织,剪 取一块蚕豆大小的肝组织。
4. 剪切：把肝组织剪成1 ～ 2mm３小块, 用无血清培养液淋洗2～3次。
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5. 消化：将肝组织块移入小瓶中, 加8ml混合消 化液, 37℃、40min, 每隔5～10min顺时针摇 匀。
6. 过滤：消化液过100目筛网, 收集滤液, 移入离 心管。
7.离心：离心800rpm, 5min, 吸弃上清液。
8. 洗涤：用无血清培养液离心洗涤１次。
9. 重悬浮及计数：用RPIM1640培养液(含10% 胎牛血清)重悬浮肝细胞, （取样计数）。
10.接种及培养：将细胞接种于培养瓶中, 密度为 106/ml (2×105/cm2), 37℃、5%CO2培 养。
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注意事项
根据组织类型选择适当的消化液。 控制消化时间，尽量减少细胞损伤。 尽快促进细胞贴壁，必要使用生长基质 涂抹瓶壁，或先少量细胞悬液接种，培 养3～5 h后，补足培养液。 适当提高细胞接种密度。

小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【摘要】为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况.结果表明:每只小鼠可获取约1.5×106个细胞,存活率>97％;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90％以上.说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】5页(P7-11)【关键词】小鼠;肝实质细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023【正文语种】中文【中图分类】Q813.11肝脏是哺乳动物机体内重要的解毒和代谢器官［1］。

当肝脏受到物理、化学或生物性损伤时，会产生肝肿瘤、中毒性肝病、肝硬化、急性重型肝炎等各种肝病［2］，而阐明各种肝病的发生机理是预防和治疗肝病、寻找开发新药物的第一步。

目前，将肝细胞分离、纯化并进行体外原代培养已成为探索肝病发病机制常用手段［3］，并在肝病相关研究中起着越来越重要的作用。

肝脏巨噬细胞(KCs)的分离 与培养
肝脏细胞悬液制备
• 门静脉穿刺，以10ml／min流量经门静脉灌注PBS ，直至肝脏呈黄白 色，总量约20ml。再用20ml 0.05％的Ⅳ型胶原酶溶液(sigma ，PBS 液稀释)门静脉灌注(小鼠不用此步骤）。
• 取下肝脏加入20ml 0.05％胶原酶，37 oC孵育40 min，经200目细胞 筛过滤。
培养基配方为DMEM（H）+双抗+10%胎牛血清 （HyClone）。
2天及3天KCs
2周及3周KCs
KCs的鉴定活力判定
• 通过形态学观察及吞噬功能鉴定活力：在体外培养的24
孔板细胞换液时，加入已消毒碳素墨水的培养基(1/250)， 2 h后倒置显微镜观察，记数200个细胞，观察具有吞噬功 能的细胞数量。0.2%台盼蓝拒染色判断细胞活力。 • F4/80免疫荧光鉴定KCs（小鼠）， CD163免疫组化鉴定 KCs（大鼠）,阳性为KCs。
非肝细胞SIP离心准备
SIP离心后细胞层与洗涤
细胞贴壁
• 把细胞按5x105/ml浓度种植于培养板中，培养2h。 取出培养板，用37℃的PBS液轻轻冲洗3次，去 除未贴壁细胞，贴壁细胞即为实验所用的KCs。刚ຫໍສະໝຸດ 离出的细胞KCs的培养方法培养
• 5％CO2、37℃、95％湿度。换液间隔时间为2d。
KCs 吞墨图像与台盼蓝拒 然图片
F4/80的免疫荧光和CD163 免疫细胞化学(x400)
• Percoll原液9份加入1份PBS（10倍浓度）配成100%的SIP。 • 取4支无菌离心管，沿着管壁加入2 mL 50％的SIP，然后倾斜（60o）
试管，轻轻的沿着管加2mL25％的SIP细胞悬液（小鼠2管，大鼠4 管）。 • 500×g，离心15 min，4oC， 50％的SIP和25％的SIP层面之间有一 层白色物，吸管轻轻的吸取之，置离心管中，用PBS离心清洗2遍， 弃上清(300×g，5min)。

小鼠肝脏窦状内皮细胞分离及培养的一种新方法第30卷第1期2010年1月国际病理科学与临床杂志 htt p://www .gjbl .netI nternati onal Journal of Pathol ogy and ClinicalMedicineVol .30 No .1Jan . 2010收稿日期:2009-10-09 修回日期:2010-01-23作者简介:赵秀华,硕士研究生,主要从事成体干细胞的研究。

通讯作者:程腊梅,E 2mail:************************基金项目:国家重点基础研究发展计划项目(2007CB947900);湖南省自然科学基金重点项目(08JJ3075)。

The work was supported by Nati onal Key Basic Research and Devel opment Pr ojects (2007CB947900)and Key Pr ojects of Natural Science Foundati on of Hunan Pr ovince,P .R.China (08JJ3075).Arti cles ?论著?小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的一种新方法赵秀华,罗彬,罗盘,程腊梅(中南大学生殖与干细胞工程研究所,长沙410078)[摘要]目的:建立小鼠肝窦状内皮细胞(liver sinus oidal endothelial cells,LSEC )的分离培养方法,研究其生物学特性。

方法:中性蛋白酶消化小鼠肝脏组织,Percoll 密度梯度离心分离消化后的细胞悬液,用内皮细胞筛选培养基及酶差异消化法纯化LSEC;免疫细胞化学染色检测LSEC 的表面标志,分析LSEC 的超微结构,观察D iI 荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(acetylated 2l ow density li pop r otein,D iI 2Ac 2LDL )摄取能力,以体外成血管能力分析LSEC 的功能。

广州大学综合设计性实验报告学院生命科学学院課程细胞生物学实验实验项目实验六细胞培养实验题目小白鼠肝细胞的原代培养专业生物技术年级、班别 14级姓名陈子禧学号 1414300004 任课教师陈鲲完成日期 2016 年 5 月 23 日[摘要] 目的掌握小鼠肝细胞、表皮细胞的体外培养方法。

采用脱臼法处死小鼠，用植块培养法（用眼科剪把肝组织剪成小于1mm³大小的植块，接种于培养瓶中进行体外培养；并用单细胞培养法（酶解法）进行肝细胞以及表皮细胞的培养。

通过光镜观察细胞形态结果成功地培养出肝细胞、表皮细胞。

肝细胞植块组在体外培养一个星期仍能够保持良好的生长状态。

结论本实验成功地实现了肝细胞的体外培养方法，尤其在植块培养组中效果更为明显。

关键词原代培养小白鼠植块培养酶解法肝细胞表皮细胞目录1前言2实验原理3实验用品3.1试剂3.1.1 培养液3.1.2 Hank液3.2 仪器3.3 材料4 实验方法4.1 前期消毒灭菌4.2 实验步骤5 实验结果5.1.图片展示5.2.结果分析5.3结果汇总6 结果分析与讨论7 参考文献8 致谢1前言目的了解肝细胞、表皮细胞原代细胞培养的基本方法及操作过程。

学习植块培养法、单细胞培养法（酶解法）、营养液的配制及酸碱度的调节。

初步掌握无菌操作方法。

意义：细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。

当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。

［1］方法：采用肝组织块外植培养法通过无菌造作培养新生小鼠细胞。

结果：运用这种方法成功地培养出原代肝细胞。

结论：这种方法为广泛开展肝细胞原代培养奠定了基础。

2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。

方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。

结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。

结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。

【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。

肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。

近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。

如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。

而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。

本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。

试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。

1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。