实验二 碱性磷酸酶提取及其比活性测定共35页

• 适用于自动生化分析仪 • 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测
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什么是ALP？
•碱性磷酸酶（ALP）是一组在碱性环境中水解磷酸酯的 酶类。 •来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁 等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人 血清中ALP主要来源于肝脏。 •是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸 单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子 和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。 •碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
底物减少量或生成物增加量 酶促反应速度=
单位时间
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实验目的
掌握酶活力测定的一般方法 掌握血清中ALP活力测定方法 与临床意义
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思考
•如何测定酶活力的大小？
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是
酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
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•实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP
pH=10
苯酚+磷酸氢二钠 红色醌亚胺衍生物 8 更快，更强，更安全
苯酚+4-氨基安替比林
混匀，37℃水浴保护15min
铁氰化钾溶液
血清
3.00
——
3.00
———
3.00
——

实验十一碱性磷酸酶的提取、比活性及Km测定(综合性实验)碱性磷酸酶的分离提取和比活性测定一、目的要求1. 熟悉从生物样品中提取与纯化酶的一般方法。

2.掌握碱性磷酸酶(AKP) 比活性的测定原理和方法。

3.了解测定酶比活性的意义。

二、实验原理本实验采取有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白，即得到含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性(specific activity)用每mg蛋白质具有的酶活性单位(u/mg·pr)来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：(1)每ml 样品中的蛋白质mg数(mg/m1)；(2)每ml样品中的酶活性单位数(U/ml)。

酶的纯度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位(King-Armstrong法)可定义为：在37℃保温15min 每产生lmg的酚为一个酶活性单位。

样品中蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

三、实验器材（一）实验材料1.兔肝（二）实验仪器1.研钵 2．刻度离心管 3．移液管 4．电动离心机 5．玻璃漏斗和玻棒6.托盘天平 7．恒温水浴 8．分光光度计 9.剪刀 10.滤纸（三）实验试剂1. 0.5mol/L乙酸镁溶液：称取乙酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。

2．0.1mol/L乙酸钠溶液：称取乙酸钠8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。

3．0.01mol/L乙酸镁-0.01mol/L乙酸钠溶液：取0.5mol/L乙酸镁溶液20ml及0.1mol/L乙酸钠溶液100ml，混合后加蒸馏水稀释到1000ml。

（四）酚标准工作液
器材：
5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿 37°C水浴锅
实验操作
取4支试管，如下操作：
立即混匀。用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色， 以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。 *保持反应时温度是均衡的，37°C
计算公式
ALP活性金氏单位定义: 每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚
• 来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、 胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较 多。正常人血清中ALP主要来源于肝脏。
• 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水 解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生 成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、 蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为 去磷酸化或脱磷酸化。
酶活力：酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是 酶促反应速度的大小。
酶促反应的速度：
常用单位时间内底物的减少量或产物的生 成量来表示。
反应速度↑ 活力↑
酶活力测定方法
• 终止测定法（或定时法）： *本次实验的方法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶 促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平 均速度。
硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测 定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中 ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。
实验小结
磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短。 该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、 快速。但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精 密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际 单位；受胆红素和溶血的干扰。 但是若用磷酸对硝基 酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯 酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害。

碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用的技术的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度一、碱性磷酸酶1、碱性磷酸酶的提取碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKP 具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

·KP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

2、碱性磷酸酶的分离纯化及采用的技术AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

其中，用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。

由于硫酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。

3、碱性磷酸酶的纯度检测酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg?pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。

在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。

唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。

二、设计实验本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。

先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。

醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。

匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。