食源性致病菌检验标准操作程序

食源性致病菌检验标准操作程序 福建省疾病预防控制中心 二〇一二年十一月 一、 生物样本检验标准操作程序 （一） 粪便样本的保存、运送和检测 表1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件 培养基 目标病原体 温度 细菌标本保存和运送 1. Cary－Blair 所有食源性致病菌 室温

增菌液 1. 改良磷酸盐缓冲液 小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 ℃ 2. mEC增菌肉汤 EHEC O157:H7/STEC 37 ℃

3. Preston肉汤 弯曲菌 微需氧42 ℃

4. SBG增菌液 沙门氏菌 37 ℃

5. 3%氯化钠碱性蛋白胨水 弧菌 37 ℃

选择性分离平板 1. Mac平板 EPEC、STEC、ETEC、EIEC、EAEC、志贺氏菌 37 ℃

2. XLD平板 志贺氏菌 37 ℃

3. mCCD平板 弯曲菌 微需氧42 ℃

4. 耶尔森氏菌选择性平板 小肠结肠炎耶尔森氏菌 25 ℃

5. 科玛嘉O157:H7显色平板 EHEC O157:H7 37 ℃

6. 科玛嘉沙门氏菌显色平板 沙门氏菌 37 ℃

7. 科玛嘉弧菌显色平板 TCBS平板 弧菌 37 ℃

病毒标本 1. 采便盒 轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒 -20 ℃以下 （二） 检验方法与流程 塑料盒装粪便样本塑料盒装

粪便样本

-20℃保存-20℃保存送省疾控检验送省疾控

检验

轮状病毒诺如病毒札如病毒星状病毒腺病毒（RT-PCR）

轮状病毒诺如病毒札如病毒星状病毒腺病毒（RT-PCR）

Cary-blair 棉拭子Cary-blair 棉拭子1支C-B 棉拭子1支C-B 棉拭子Mac和XLD分离Mac和XLD分离志贺志贺1支C-B 棉拭子1支C-B 棉拭子Mac分离Mac分离致泻致泻1支C-B 棉拭子1支C-B 棉拭子CIN耶尔森选择培养基分离CIN耶尔森选择培养基分离耶尔森耶尔森1支棉拭子蘸取少量样本1支棉拭子蘸取少量样本改良PBS冷增菌改良PBS冷增菌1支C-B 棉拭子1支

C-B 棉拭子

改良mCCD分离改良mCCD

分离

弯曲菌弯曲菌Preston肉汤增菌Preston肉汤增菌鉴定鉴定结果报告结果报告结果报告，菌株报送省疾控复核、分型、药敏结果报告，菌株报送省疾控复核、分型、药敏1支棉拭子蘸取少量样本1支棉拭子蘸取少量样本SBGSBG科玛嘉显色培养基科玛嘉显色培养基沙门沙门1支棉拭子蘸取少量样本1支棉拭子蘸取少量样本3%氯化钠3%氯化钠科玛嘉显色培养基或TCBS科玛嘉显色培养基或TCBS副溶副溶

1支棉拭子蘸取少量样本1支棉拭子蘸

取少量样本

mEC肉汤mEC肉汤科玛嘉显色培养基科玛嘉显色

培养基

O157:H7O157:H7

1支棉拭子蘸取少量样本

1支棉拭子蘸取少量样本

粪便样本（三） 沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。 2 检验程序 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1。

图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 粪便或肛拭子

挑取3个或以上可疑菌落，接种于5％羊血琼脂平板

报告 进行系统生化鉴定、血清学试验 TSI，赖氨酸，MIO，西蒙氏柠檬酸盐琼脂，尿素

SBG增菌液 XLD和MAC 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 直接 科玛嘉沙门显色培养基

TSI:K/Ag++ 赖氨酸:+ MIO:+/-/+ 柠檬酸盐:+ 尿素:- TSI:K/A tr 赖氨酸:+ MIO:+/-/- 柠檬酸盐:- 尿素:- TSI:K/Ag 赖氨酸:- MIO:+/-/+ 柠檬酸盐:- 尿素:- TSI:K/A 赖氨酸:- MIO:-/V/- 柠檬酸盐:- 尿素:- 反应结果与左侧描述不符 TSI:K/A 赖氨酸:- MIO:-/-/+ 柠檬酸盐:- 尿素:-

沙门氏菌属 伤寒沙门氏菌 甲型副伤寒沙门氏菌 志贺氏菌属 宋内志贺氏菌

可能是肠道菌群，或者需要额外试验以排除其他致病菌或生化不典型的沙门氏菌或志贺氏菌分离株

36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 3 操作步骤 3.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。 所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h内送检。 3.2 分离培养 3.2.1 直接分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在XLD和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。 肛拭子：操作程序同新鲜粪便。 转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在XLD和MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入SBG增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG增菌液。 平板36 ℃1 ℃培养18 h～24 h。 3.2.2 增菌培养 增菌液于36 ℃1 ℃培养18 h～24 h，采用上述方法于科玛嘉沙门氏菌显色平板上划线分离，36 ℃1 ℃培养18 h～24 h。 3.3 菌落特征 3.3.1 选择性平板上可疑菌落的特征见表1。 表1 沙门氏菌属和志贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 （大多数） 伤寒沙门氏菌 志贺氏菌属

MAC琼脂 菌落光滑、无色，直径2 mm～3 mm XLD琼脂 菌落呈红色，直径2 mm～4 mm 科玛嘉显色培养基 紫色或酒红色 紫色或酒红色

3.4 纯培养 挑取3个或以上可疑菌落，划线接种5%羊血琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 3.5 初步鉴定 可疑菌落接种TSI琼脂，赖氨酸脱羧酶培养基、动力-靛基质-鸟氨酸琼脂（MIO）、西蒙氏柠檬酸盐琼脂和尿素琼脂。沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别见表2。 表2 沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别表 项目 沙门氏菌 （大多数） 伤寒 沙门氏菌 甲型副伤寒 沙门氏菌 志贺氏菌属 TSI（斜面） K K K K TSI（底层） A A A A TSI（产气） ＋ － ＋ ＋ TSI（硫化氢） ＋ 少量 － － 赖氨酸 ＋ ＋ － － MIO（动力） ＋ ＋ ＋ － MIO（靛基质） － － － 可变 MIO（鸟氨酸） ＋ ＋ ＋ 痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌：－ 宋内志贺氏菌：＋ 柠檬酸盐（西蒙氏） ＋ － － － 尿素 － － － － 3.6 血清学鉴定 挑取5%羊血琼脂平板上的菌落，进行沙门氏菌和志贺氏菌的血清学鉴定，设盐水对照。 3.7 确定鉴定 刮取5%羊血琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。

4 结果与报告 报告粪便标本中检出沙门氏菌或志贺氏菌。 5 菌株的保存和上送 培养物穿刺接种半固体培养基，轻拧管盖，36 ℃±1 ℃培养24 h，盖紧管盖。如果需要长期保存菌株，将0.7 mL 脑心浸液肉汤6 h～12 h培养物和0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置－70 °C保存。按照方案要求定期上送。 （四） 致泻大肠埃希氏菌检测操作程序

1 范围 本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法。

2 操作步骤 2.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。 所采集的标本尽快检验，放入Cary-Blair运送培养基中的标本应在冷藏条件下24 h内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下8 h内送检。 2.2 直接分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。 肛拭子：操作程序同新鲜粪便。 转移至Cary-Blair运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在MAC一区划线；以1 µL无菌接种环或接种针划线分离。 平板36 ℃1 ℃培养18 h～24 h。 2.3 菌落特征 挑取5个可疑大肠埃希氏菌菌落（粉红色、突起、光滑、湿润）直接保存半固体菌种管；采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌。

3 多重PCR鉴定 3.1 标准菌株 标准菌株一览表见表3。 表3 标准菌株一览表 菌株名称 标准号 来源 EPEC CMCC 44155 中国食品药品检定研究院 STEC 具有stx1、stx2毒力基因 中国疾病预防控制中心传染病所 ETEC CMCC 44815 中国食品药品检定研究院 EIEC CMCC 44825 中国食品药品检定研究院 EAEC 042血清型 中国疾病预防控制中心传染病所 大肠埃希氏菌 ATCC 25922 WHO

3.2 引物合成 多重PCR引物序列见表4。 表4 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列

目标菌 目标基因 引物序列 片段大小（bp） EPEC、STEC escV–F 5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′ 544

escV–R 5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′ EPEC bfpB–F 5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′ 910 bfpB–R 5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′ STEC stx1A–F 5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′ 244 stx1A–R 5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′ stx2A–F 5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′ 324 stx2A–R 5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′ ETEC Elt–F 5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′ 655 Elt–R 5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′ estIa–F 5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′ 157 estIa–R 5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′ estIb–F 5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′ 171 estIb–R 5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′ EIEC invE–F 5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′ 766 invE–R 5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′