猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒_PRRSV_检测方法的建立
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文章编号:1000-1573(2009)01-0082-04
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)检测方法的建立①
苏晓鸥1, 李玉荣2, 乔俊文1, 赵德明1(1.中国农业大学动物医学院国家动物海绵状脑病实验室,北京100193;
2.河北农业大学动物科技学院,河北保定071000)
摘要:根据GeneBank中已经发表的PRRSV毒株的ORF6基因高度保守序列,设计并合成了一对特异性引物,
建立了用于检测PRRSV的RT-PCR诊断方法。从感染PRRSV-QD的Marc-145细胞中提取病毒RNA,然后经RT-PCR扩增,获得预期266bp的目的片断,而猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)细胞培养物及Marc-145细胞进行同条件检测,结果为阴性;PRRSV扩增产物测序结果与GeneBank中
已发表的PRRSV毒株序列同源性达9414%～9714%且应用本研究检测方法对已知基因型的10株PRRSV盲检,检出率100%。上述研究结果表明,所建立的RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断。关 键 词:猪繁殖与呼吸综合征;PRRSV;ORF6;RT-PCR;检测中图分类号:S852.65文献标识码:A
Theestablishmentofdetectingmethodforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)
SUXiao2ou1,LIYu2rong2,QIAOJun2wen1,ZHAODe2ming1(1.NationalAnimalTransmissibleSpongiformEncephalopathyLaboratory,
CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China)
Abstract:BasedonhighlyconservativeORF6genesequenceofPRRSVonGeneBank,apairofprimerswasdesignedandsynthesized.TheRT-PCRmethodfordetectingPRRSVwasestab2lished.PRRSV-QDRNAwasextractedfromvirus-infectedMarc-145cellandthenamplifiedbyRT-PCR.Thepositive266bpspecificfragmentwasobtainedasexpected.Underthesamecon2ditions,however,theresultsfordetectionofPRV,PPV,PCVandMarc-145cellbyRT-PCRwereallnegative.TheamplifiedsequenceofPCRproductofPRRSV-QDshares9414%-9714%homologywiththepublishedsequenceofotherPRRSVstrainsfromGeneBank.TheresultsindicatethatRT-PCRmethodinthisresearchhashighsensitivityandspecificity,andcouldbefurtherap2pliedforPRRSVclinicaldiagnosis.Keywords:porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus;PRRSV;ORF6;RT-PCR;de2tecting
①收稿日期:2008-07-03
基金项目:科技部:兽医微生物菌种资源标准化-朊病毒类资源标准化整理整合及共享(2005KDA21205-7);实验用小型猪地方标准研究;北京市科委(D07080200720701)作者简介:苏晓鸥(1982-),女,辽宁沈阳人,在读硕士生,主要从事分子病理学科研工作.E2mail:xiaoousu@163.com
通讯作者:赵德明(1958-),男,教授,博士生导师,主要从事分子病理学科研工作.E2mail:zhaodm@cau.edu.cn
第32卷第1期2009年1月河北农业大学学报JOURNALOFAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI
Vol.32No.1
Jan.2009 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末出现在美国和欧洲的一种猪的新病毒性疾病,其主要症状表现为妊娠母猪早产、流产、产死胎和木乃伊胎以及仔猪出现呼吸困难为主要特征的传染病[1]。目前,PRRS几乎遍布了所有养猪国家,对我国乃至世界养猪业造成严重经济损失。PRRS的病原为PRRSV,是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,基因组长约15kb含8个开放阅读框(ORFs)[2]。ORF5～7编码病毒的主要结构蛋白,其中ORF6编码病毒的基质蛋白(M)。PRRSV的基因型有两种,欧洲型和美洲型[3]。在这两种基因型之间,ORF6这段基因片段具有高度保守性[4]。所以,鉴于PRRSV这一特点,本研究根据GeneBank中的已经发布的PRRSVORF6序列的高度保守区设计了一对引物,建立并优化了PRRSV的RT-PCR检测方法,以期用于临床PRRSV的快速诊断,同时也将有助于PRRSV流行病学的调查研究。1 材料与方法1.1 毒株与细胞PRRSV-QD(为青岛所分离本试验室鉴定保存)、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒均为本实验室分离和保存毒株;Marc-145细胞为中国农业大学传染病与微生物组郭鑫老师馈赠。1.2 主要试剂Trizol试剂、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC、dNTPmix、DNAMarker均购于北京通宝达生物科技发展有限公司,胶回收试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。1.3 引物设计与合成根据GeneBank中已经发表的VR-2332毒株的ORF6(14629～14895位核苷酸)基因序列,通过引物设计软件Oligo610设计了一对引物,可用于扩增出266bp的基因片断。引物送由上海生物工程有限公司合成。上游P1:5’-TTTGGGGAGTGTACTCGGC2CATAGA-3’下游P2:5’-GGCATATTTGACAAGGTTT2ACCACT-3’1.4 RNA的提取取PRRSV-QD、PRV、PPV、PCV及Marc-145的细胞培养液各200μL于4个不同的115mL的离心管中,每个离心管中加入800μLTrizol试剂,摇匀后室温静置5min,加200μL氯仿剧烈震荡15s混匀,室温静置10min,12000r/min4℃离心15min,RNA存在于上层水相中。小心吸取上清转入另一新的DEPC水处理过的115mL离心管中,加入等体积的冰异丙醇,室温静置10min,
12000r/min离心10min,弃上清同上,加入1mL的75%乙醇洗涤沉淀,轻轻摇匀。7500r/min离心5min,吸弃上清液,室温干燥5～10min。用20μL无RNase水溶解沉淀,-80℃保存。1.5 RT-PCR1.5.1 反转录(Reversetranscription) 在115mL离心管中分别加入5
μL总RNA,1μ
L的随机引物,
混匀。70℃加热5min后立即冰浴,按顺序加入以下试剂:6
μL5×RT-缓冲液,1μ
LRNase抑制剂,
2μLDTT,2μLdNTP,1μLAMV反转录酶;215
μLdNTP,1315μLDEPC水,42℃孵育1h;72℃作
用10min,取出-20℃保存备用。1.5.2 聚合酶链式反应(PCR) PCR反应总体积为20
μL,其中灭菌双蒸水6μL,10×buffer2μ
L,
dNTPmix10μL,上游引物(P1)015μL,下游引物
(P2)0.5μL,cDNA模板3μL,按下列程序进行
PCR反应:94℃5min;95℃30s,64℃30s,72℃45s,30个循环;72℃延伸10min。PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳。1.6 测序及序列分析序列测定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成后,应用DANMAN软件将所测得的核酸序列与GeneBank中所发表PRRSV基因序列HQ-5
(EU177111),GCH-3(EU177121),LV
(AF184212),VR2332(U87392),ORF6对应区域
进行序列比较分析。1.7 方法应用用本研究中已经建立的RT-PCR检测方法对本验室室保存的已知基因型的10株不同的PRRSV
毒株(其中3株为欧洲型,另7株为美洲型)进行盲检。将得出结果与已知情况相对比。
2 结果与分析2.1 RT-PCR扩增结果及特异性应用上述引物和反应体系,对PRRSV-QD、PRV、PPV、PCV细胞培养物及Marc-145细胞进行RT-PCR扩增,结果仅PRRSV-QD扩增出266bp的特异性片段(图1),与预期结果相符。其他病毒无任何扩片段。从而证实了本研究建立的IBDVRT-PCR检测方法的有效性和特异性。
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