MicroRNA regulation in Arabidopsis thaliana

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2017, 43(6): 839-848/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2017.00839桑树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(MnACO)启动子功能分析余建刘长英赵爱春王传宏蔡雨翔余茂德*西南大学生物技术学院 / 西南大学农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室, 重庆 400715摘要: 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)作为关键酶, 能够催化1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)形成乙烯。

为探究桑树MnACO基因在桑树生长发育和抵御外界胁迫中的功能, 本研究构建了pMnACO::GUS的植物表达载体并转化拟南芥。

采用GUS组织染色法鉴定转基因拟南芥不同生长阶段及胁迫处理后的GUS活性。

通过PCR克隆得到MnACO1和MnACO2启动子片段, 它们分别为1518 bp和1429 bp, 启动子区域有大量的TATA-box、CAAT-box和其他响应外界刺激的顺式作用元件。

GUS活性分析显示MnACO启动子能驱动GUS在拟南芥中表达; MnACO1启动子能驱动GUS在拟南芥的根、叶片、花瓣、花药、花丝、柱头以及果荚中表达, 且活性较MnACO2强; MnACO2启动子不能驱动GUS在果荚中无表达。

转MnACO1和MnACO2植株经不同逆境处理后GUS表达活性不同, 转MnACO1植株的GUS活性随处理延长时间而减弱, 转MnACO2植株GUS活性随处理时间延长而增强。

qRT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后MaACO1和MaACO2的基因表达量, 发现MaACO基因的表达模式与MnACO启动子GUS活性变化趋势一致。

本研究结果表明, MnACO为诱导型启动子, MnACO1兼具组成型启动子特性, MnACO2兼具组织特异型启动子特性。

2. TTC又名红氮四唑，标准氧化还原电位为-80mv。 3. 三苯基甲腙（TTF triphenyl formazan）红色 4. TTC是用HCl配制的，当它溶于水中，pH为3~5，因此要
加入等体积的0.1M pH7.5的磷酸缓冲液（该实验用的为 1/15）。这样反应液的pH为6.8左右。如不用，TTC反应 液过酸，会杀死根。另外TTC加磷酸缓冲液后要避光，最 好临时配制使用，在暗处保存时间要短。否则见光会变红， 影响反应的准确性。
在试管中加入95%乙醇至5 mL刻度线 ，沸水水浴抽提10 min，冷却后用95%乙醇定容至5mL刻度线 （如果颜色深可 以增加体积，以便比色，两个处理定容体积一致），溶液混 匀后，在530 nm处测定吸光值（水为空白比色）。根据OD 值计算根系相对活力（B÷A) ×100%。
2. Evans blue ： A、B两组分别0.3 g根尖段放入15ml试管中 （标号为EA、EB），加入6 mL0.125％ Evans blue 染色液 染色，15min后将Evans blue染色液倾倒回公用烧杯（回 收！！），随后用水充分洗净根系表面色素（冲洗3-5次）。
实验原理
1. TTC法：
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准的氧化还原色素， 其氧化态无色并溶于水，还原态则是不溶于水的三苯 基甲腙（TTF）红色物质，它在空气中不会自动氧化、 相当稳定。根系细胞中脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶） （或活细胞的NADH，NADPH）可பைடு நூலகம்为TTC的氢供体， 从而将TTC还原为TTF。外加琥珀酸可增强TTC的还原。
3. FDA方法※
FDA ：二乙酸荧光素（Fluoresencein diacetate，母液为 5 mg/mL的FDA DMSO溶液，储存在0℃） FDA是一种非极性酯类物质，可以通过质膜进入细胞质， 在细胞内酯酶的作用下水解脱去酯基团后在490-500 nm 激发光下产生绿色荧光。 FDA （2µg/mL）被普遍用于细胞活力的测定 活力低的细胞具有较低的酯酶活性，因此绿色荧光较弱

湖南大学硕士学位论文拟南芥中与蓝光受体CRY2相互作用蛋白的生化分析姓名：***申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：***20091101硕上学位论文摘要隐花色素ＣＲＹ２（ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ２）是植物感受蓝光的光受体之一，它介导了蓝光调节植物的光形态建成反应，如抑制下胚轴的伸长、调节昼夜节律、激活基因转录和调节开花等。

Ｃａｓｈｍｏｒｅ等人１９９３年就确定ＣＲＹ２是植物的蓝光受体，但是直到现在，在蓝光受体ＣＲＹ２信号传导方面的研究一直没有重大突破；因此，首先有必要通过各种分子生物学与遗传学的方法找到与蓝光受体ＣＲＹ２相互作用的蛋白，为进一步研究ＣＲＹ２介导的信号传导途径奠定基础。

本研究首先构建了酵母双杂交载体ｐＢｒｉｄｇｅ—ＣＲＹ２，然后以ｐＢｒｉｄｇｅ·ＣＲＹ２作为Ｂａｉｔ对构建在Ｐｒｅｙ载体ＰＡＣＴｌ中的酵母双杂交文库进行了筛选。

通过筛选酵母双杂交文库发现蓝光下ＣＲＹ２可能与多种蛋白发生相互作用。

其中包括生物钟核心振荡器组分蛋白ＬＨＹ与ＣＣＡｌ，翻译起始因子ＥＩＦ４Ｅ，磷酸酶ＡＴ３Ｇ５１３７０，以及激酶ＣＫＡ２和ＣＫＩ。

本课题重点对ＣＲＹ与生物钟相关蛋白的相互作用进行了深入研究。

通过ＲＴ－ＰＣＲ克隆了ＣＫＡ２，￡日】，，ＣＣＡｌ基因，并成功构建了ｐＧＡＤＴ７．ＣＫＡ２，ｐＧＡＤＴ７．ＬＨＹ，ｐＧＡＤＴ７．ＣＣＡｌ载体。

我们通过营养缺陷型培养试验，滤纸显色反应和液相显色反应检测了在蓝光和黑暗条件下ｐＢｒｉｄｇｅ．ＣＲＹ２与ｐＧＡＤＴ７．ＣＫＡ２，ｐＧＡＤＴ７．ＬＨＹ，ｐＧＡＤＴ７．ＣＣＡｌ在酵母体内的相互作用。

结果发现：ＣＲＹ２蛋白在蓝光条件下与ＣＫＡ２有较强的相互作用，而与ＬＨＹ，ＣＣＡｌ的相互作用较弱，而且ＣＲＹ２与ＣＫＡ２，ＬＨＹ，ＣＣＡｌ的相互作用强度与蓝光光强呈正相关；而在黑暗条件下ＣＲＹ２与所检测蛋白均无相互作用。

成功构建了ｐＣｏｌｄＴＦ．ＣＫＡ２，ｐＣｏｌｄＴＦ．ＬＨＹ，ｐＣｏｌｄＴＦ．ＣＣＡｌ原核表达载体，并采用大肠杆菌ＢＬ２１表达得到了可溶的重组蛋白。

植物保物研究方法论文题目：现代技术在植物病理学中的应用学院(系)：植物保护学院专业年级：植物病理学学生姓名：***学号：**********CRISPR/cas基因编辑系统在植物病理学中的应用摘要：基因组定点编辑是利用人工核酸酶，对复杂生物基因组特定位点快速而精确地进行遗传改造的一项新技术。

尤其是最近从细菌和古细菌的获得性免疫防御反应中改造而来的CRISPR/Cas9系统，因其简单、廉价、高效以及通用的特性，目前已经广泛地应用于植物、动物、微生物等各种生物体和细胞的基因功能和应用研究中。

CRISPR/Cas9系统的原理在于其携带的Cas9核酸酶RNA导向的dsDNA结合蛋白，能够在靶位点对双链DNA 进行定点切割，随后引发的非同源末端连接或者同源重组修复，导致了靶位点DNA的缺失、插入、替换甚至染色体大片段重排。

关键词：基因, CRISPR, 植物病理Abstract：The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated proteins(Cas9)system is a recently developed groundbreaking technology which enables the production of highly specific genome modification with high efficiency and specificity. The CRISPR/Cas9 system is derived from the adaptive immunity system in bacteria and archaeas, it uses Cas9, a RNA-guided nuclease, to create double-strand breaks in the genomic loci of interest. The repair of breaks through either non-homologous end joining or homonlogous recombination leads to insertions, deletions, replacements or larger chromosomal rearrangements at the desired sites of genome. The CRISPR/Cas9 system is facile, highly efficient and widely used in diverse cells and organisms, including the species that have traditionally been a challenge in their genetic manipulations.Key words: Gene, CRISPR, Plant disease1. CRISPR/Cas基因编辑系统1.1 CRISPR/Cas基因编辑系统的发展CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术，即一种由RNA介导的切割特异DNA片段的基因编辑系统引起了科学家们的注意。